菱角殼黃酮提取工藝優(yōu)化及抑腫瘤細(xì)胞增殖活性作用

雷秋琪，葉詩潔，黃永康，楊 過，周 敏,3，王宏勛,3，王麗梅,3,

（1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430023；3.湖北省生鮮食品工程技術(shù)研究中心，湖北武漢 430023）

菱角作為我國民間一種藥用佳果已有幾千年的歷史[1]。根據(jù)《中華藥海》所記載：“菱殼性味微苦、澀，性涼，入肺、脾、腸三經(jīng)，具有解毒療瘡、澀腸止瀉、清華濕熱的功效”?！吨兴幋筠o典》記載：“菱殼可治腹瀉、脫肛、痔瘡、黃水瘡、天泡瘡”。研究表明，菱角殼具有抗腫瘤細(xì)胞增殖、抗氧化、抗菌、降糖和抗炎等作用[2-5]。在中國的民間用藥中，菱角殼被用于輔助治療癌癥[6-10]。牛鳳蘭等[11]用富含三羥基苯甲酸二聚體粗菱殼水提物對(duì)MFC 荷瘤小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)菱角殼水提物具有抑瘤效果而且存在量效關(guān)系。文獻(xiàn)報(bào)道菱角殼中含有生物堿、酚酸類、萜類、黃酮類及多糖等功能成分[12-14]。李麗等[15]對(duì)東北菱黃酮類化合物的成分進(jìn)行定性定量分析，發(fā)現(xiàn)其中可能含有黃酮苷或苷元、山奈酚、高良姜素的2 個(gè)對(duì)映異構(gòu)體以及多種其他成分。黃酮[16-17]具有抗氧化性[18-19]，可作為天然抗氧化劑用于食品行業(yè)。另外，黃酮還具有抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、保護(hù)肝臟等功效[20-25]，可用于相關(guān)疾病的藥物開發(fā)。常見的黃酮提取方式有熱水浸提法[26]、有機(jī)溶劑提取法[27]、超聲波提取法[28-29]、酶解法[30]、膜分離提取法[31]、超臨界流體萃取[32]。其中，熱水浸提、有機(jī)溶劑提取法等是實(shí)驗(yàn)室常見提取工藝。主要依據(jù)相似相溶的原理[27]，一般具有操作簡單、實(shí)驗(yàn)器材要求低、節(jié)約成本等諸多優(yōu)點(diǎn)。另外， 酶解法具有高度專一的特性，能夠避免使用有機(jī)試劑且具有較高的提取率，但作用條件不便于調(diào)控。膜分離濃縮可以減少干燥時(shí)間，提高干燥效率。超臨界CO2萃取是目前國際上公認(rèn)的先進(jìn)物理萃取技術(shù)，主要是運(yùn)用其溶劑力將超臨界流體與萃取物接觸，選擇性分離提純。但這三種提取方式均成本較高，不適于大規(guī)模生產(chǎn)。

根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀，黃酮已經(jīng)廣泛用于植物抗腫瘤活性的研究中[33]，但將菱角殼黃酮用于抗腫瘤活性的文獻(xiàn)并不多見。其中Hela 作為常見的人源腫瘤細(xì)胞[34-35]，也沒有相關(guān)報(bào)道將其用于驗(yàn)證菱角殼黃酮的抗腫瘤活性。常見的用來檢測腫瘤細(xì)胞增殖活性的方法有很多[36-37]，如：臺(tái)盼藍(lán)染色法、3H 放射性同位素?fù)饺敕?、MTT 法、細(xì)胞儀法等。MTT 法形成的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）物質(zhì)不溶于水[28]，添加有機(jī)溶劑溶解后，因?yàn)闂壢ド锨逡旱耐瑫r(shí)可能會(huì)丟失少部分的Formazan，因此可能會(huì)產(chǎn)生誤差。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，目前更常用CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖活性。CCK-8 法比MTT 法對(duì)細(xì)胞濃度變化更敏感，測得的結(jié)果則更為準(zhǔn)確。

因此，本研究以湖北洪湖菱角種植區(qū)所產(chǎn)的菱角取殼做為原料，采用單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化菱角殼黃酮提取工藝，運(yùn)用CCK-8 法檢測菱角殼黃酮對(duì)人宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖的影響。拓展黃酮類物質(zhì)的提取來源，為菱角殼黃酮的體外的抗腫瘤活性研究及菱角殼的開發(fā)利用理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菱角殼（兩角菱，Water chestnut shell） 湖北洪湖菱角種植地；人宮頸癌Hela 細(xì)胞株 武漢百邁生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、蘆丁標(biāo)品、亞硝酸鈉（NaNO2，分析純）、硝酸鋁（Al（NO3）3，分析純）、氫氧化鈉（NaOH，分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、DMEM（Dulbecco’s modified Eagle's medium）高糖培養(yǎng)基 塞默爾飛世爾生物化學(xué)制品有限公司；5-氟尿嘧啶（5-Fu）sigma 公司；胎牛血清（Fetal Bovine Serum） 浙江天杭生物科技有限公司；青霉素鏈霉素溶液-雙抗（后文均簡稱雙抗） 上海斯信生物科技有限公司；胰蛋白酶（Trypsin）、乙二胺四乙酸（EDTA） 吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO） 湖北百奧斯生物科技有限公司；細(xì)胞活力檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 日本同仁試劑公司。

BL 2000F 型電子天平 上海升隆電子科技有限公司；PL402-L 型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；HH-S114 型電熱恒溫水浴鍋 上海太倉精宏儀器設(shè)備有限公司；721-100 型紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技儀器有限公司；T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、凍存管 北京中創(chuàng)先鋒科技有限責(zé)任公司；96 孔培養(yǎng)板 上海化科實(shí)驗(yàn)器材有限公司；CW-CJ-2FD 型雙人單面凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備公司；SCHP-80 型CO2培養(yǎng)箱 深圳市奧德瑪電子科技有限公司；BX19-HK830 型倒置顯微鏡 奧林巴斯有限公司；SUNRISE 型酶標(biāo)儀 奧地利Tecan 公司；普通冰箱、-80 ℃低溫冰箱 海爾集團(tuán)；DHG-9145A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16GB 型離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造；GR60DA 型立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SCIENTZ-12N 型真空冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 選用新鮮的菱角，摘去果肉，將菱角殼洗干凈之后放在40 ℃烘箱中烘干，用藥物粉碎機(jī)粉碎，過80 目篩得菱角殼粉，4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 通過實(shí)驗(yàn)室原有實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及相關(guān)文獻(xiàn)資料，確定了對(duì)菱角殼總黃酮含量有明顯影響的四個(gè)因素：提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度、提取時(shí)間。

a：提取時(shí)間對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響：準(zhǔn)確稱取15 份菱角殼粉，每份1.0 g，置于500 mL 三角瓶中，分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組三個(gè)平行。選取濃度為70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，選取1:30 的料液比，將三角瓶分別放置在50 ℃恒溫水浴鍋中提取，并分別提取10、30、50、70、90 min，提取結(jié)束后用紗布進(jìn)行過濾，得到樣品液，冷卻待測。

b：料液比對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響：選取濃度為70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，料液比分別為1:20、1:30、1:40、l:50、1:60，將三角瓶分別放置在50 ℃恒溫水浴鍋中提取50 min，其余實(shí)驗(yàn)操作與提取時(shí)間實(shí)驗(yàn)組相同。

c：乙醇濃度對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響：分別選取濃度為30%、40%、50%、60%、70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，料液比為1:30，將三角瓶分別放置在50 ℃恒溫水浴鍋中提取50 min，其余實(shí)驗(yàn)操作與提取時(shí)間實(shí)驗(yàn)組相同。

d：提取溫度對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響：選取濃度為70%的乙醇水溶液作為其提取溶劑，料液比為1:30，將三角瓶分別放置在40、50、60、70、80 ℃恒溫水浴鍋中提取50 min，其余實(shí)驗(yàn)操作與提取時(shí)間實(shí)驗(yàn)組相同。

1.2.3 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 如表1所示，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，結(jié)合Box-Behnken 中心組合的試驗(yàn)來設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)，分析影響菱角殼黃酮提取得率主要因素，得出最佳提取工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Response surface experimental factor level

1.2.4 總黃酮含量的測定方法：

1.2.4.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別準(zhǔn)確量取0.3 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液（無水乙醇溶解）1、2、3、4、5、6、7、8 mL 置于25 mL 容量瓶中，取無水乙醇分別補(bǔ)充至1 mL，加超純水至12.5 mL，再加入5% NaNO2溶液0.7 mL，充分混合均勻，靜置5 min。再加入10%Al（NO3）3溶液0.7 mL，混合均勻，靜置6 min 后，加入1 mol/L NaOH 溶液5 mL。最后加入無水乙醇補(bǔ)充樣液的總體積至25 mL，混合均勻，靜置10 min。另取1 mL 無水乙醇，按照相同步驟進(jìn)行處理后作為空白對(duì)照，在最大吸收波長510 nm 處，使用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度，以吸光度Y 值為縱坐標(biāo)（Y），以相應(yīng)試管中濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。

1.2.4.2 測定樣品中總黃酮含量 取1 mL 樣品液（無水乙醇溶解），置于25 mL 容量瓶中，加超純水至12.5 mL，再加入5% NaNO2溶液0.7 mL，混合均勻，靜置5 min。再加入10% Al（NO3）3溶液0.7 mL，混合均勻，靜置6 min，加入1 mol/L NaOH 溶液5 mL，最后加入無水乙醇水補(bǔ)液至25 mL，搖勻之后再靜置10 min。直接取1 mL 超純水按照相同步驟進(jìn)行處理后作為空白對(duì)照，在最大吸收波長510 nm 處，使用紫外可見分光光度計(jì)測定吸光度，最后結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測定樣品中總黃酮濃度計(jì)算總黃酮提取得率。樣品中總黃酮得率式中，C 為由標(biāo)曲得出的總黃酮濃度，mg/mL；V 為樣液總體積，mL；m 為菱角殼粉的質(zhì)量，g。

1.2.5 菱角殼黃酮對(duì)Hela 細(xì)胞增殖活性的影響

1.2.5.1 藥品配制方法 a：培養(yǎng)基：以DMEM 高糖培養(yǎng)基:胎牛血清:雙抗=90:10:1 的比例，取45 mL的DMEM 高糖培養(yǎng)基5 mL 胎牛血清、0.5 mL 雙抗配制成50 mL 培養(yǎng)基。

b：凍存液：將DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO 按照7:3:1 比例混合配制成凍存液，密封保存于4 ℃冰箱。

1.2.5.2 菱角殼黃酮純化及樣品配制 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室研究基礎(chǔ)以及現(xiàn)有研究成果[38-39]，采用AB-8 大孔樹脂對(duì)菱角殼黃酮粗體物進(jìn)行純化，以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)處理：將AB-8 大孔吸附樹脂用無水乙醇浸泡24 h 以充分溶脹后，95%乙醇沖洗至洗出液加5 倍量超純水時(shí)無白色渾濁，超純水洗三次，密封保存，備用。再生：將使用過樹脂用無水乙醇洗脫至無色后，0.5 mol/L 鹽酸浸泡2 h，水洗至中性，0.5 mol/L NaOH 浸泡2 h，水洗至中性。純化工藝為：將處理過的AB-8 大孔吸附樹脂加入26×50 mm 層析柱中，吸附流速0.8 mL/min，一次洗脫上樣體積為20 mL，樣品濃度10 mg/mL，用70%乙醇溶液洗脫，洗脫樣品的流速為0.8 mL/min，經(jīng)純化濃縮凍干后得到菱角殼黃酮純化物。

菱角殼黃酮溶液的配制：按照1.2.1 中得出的提取工藝進(jìn)行菱角殼黃酮粗提取物的提取，并取一定量菱角殼黃酮粗提物按照上述方法進(jìn)行純化。分別稱量80 mg 菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu 溶解于1 mL DMSO 溶液中，用DMEM 培養(yǎng)基分別稀釋到50、100、200、400、500、600、700、800 μg/mL。黃酮不溶于水，可溶于DMSO，而DMSO溶液本身對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，以DMSO 作為溶劑配置相應(yīng)濃度的藥品時(shí)，其濃度不可高于0.5%。

1.2.5.3 Hela 細(xì)胞復(fù)蘇 將凍存于-80 ℃冰箱裝有Hela 細(xì)胞的凍存管取出后迅速放入37 ℃水浴鍋中快速解凍，解凍后立即停止水浴，將凍存管移入超凈工作臺(tái)，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞使之懸浮混勻，將凍存管所有細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管中離心（1000 r/min，5 min），離心結(jié)束后棄去離心管中的上清液。在離心管中加入1 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹打離心管底部，使底部細(xì)胞懸浮并與DMEM 高糖培養(yǎng)基充分混勻。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，加入4 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基，將瓶蓋擰緊，水平劃十字搖勻后將培養(yǎng)瓶放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。放入培養(yǎng)箱之前注意用75%酒精噴灑培養(yǎng)瓶，以達(dá)到滅菌目的。放入培養(yǎng)箱之后適度將瓶蓋擰緊后再回轉(zhuǎn)半圈，以達(dá)到與培養(yǎng)箱通氣目的。每24 h 換液一次：把培養(yǎng)基吸出，加1 mL PBS，蓋上瓶蓋輕輕搖動(dòng)后棄去PBS，反復(fù)清洗三次，在培養(yǎng)瓶中加入5 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基，最后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.5.4 細(xì)胞傳代 首先在倒置顯微鏡下觀察，將融合度大于90%的培養(yǎng)瓶挑出，棄去培養(yǎng)基，向培養(yǎng)瓶中加入1 mL PBS 清洗細(xì)胞，隨后棄去PBS，反復(fù)三次，在培養(yǎng)瓶中加入1 mL 胰蛋白酶消化1 min，立即棄去胰蛋白酶。在培養(yǎng)瓶中加入1 mL DMEM 高糖培養(yǎng)基，終止消化，用移液槍將瓶壁上剩余的細(xì)胞輕輕吹打使之脫落。將培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到15 mL離心管內(nèi)，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液。按照適當(dāng)密度在離心管中加入2～3 mL 培養(yǎng)基，用移液槍輕輕吹打使離心管底部細(xì)胞浮起，再將離心管中細(xì)胞轉(zhuǎn)移1 mL 至裝有4 mL 培養(yǎng)基的T25 瓶內(nèi)，輕輕搖勻，定期觀看細(xì)胞生長狀態(tài)。Hela 細(xì)胞傳代培養(yǎng)若干代后，待Hela 細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，細(xì)胞活力增強(qiáng)，細(xì)胞密度明顯增大，此時(shí)的細(xì)胞就可以用于CCK-8 法測定藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。

1.2.5.5 細(xì)胞凍存 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，凍存前2 h換液一次，用胰蛋白酶消化制成細(xì)胞懸浮液，轉(zhuǎn)移到離心管中離心（1000 r/min、5 min）后棄去上清液。在離心管中添加1.5 mL 凍存液，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞，使之懸浮并與凍存液混勻后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管中。用封口膜密封，貼上標(biāo)簽，標(biāo)記名稱、時(shí)間。實(shí)行分階段降溫：4 ℃保存2 h，隨后-20 ℃保存2 h，最后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至-80 ℃下凍存。

1.2.5.6 CCK-8 法測定菱角殼黃酮對(duì)Hela 細(xì)胞增殖抑制作用 實(shí)驗(yàn)開始前首先用胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞制成懸浮液，置于15 mL 離心管中離心（1000 r/min，5 min），最后在離心管中加入8 mL 培養(yǎng)基。將濃度為1×105cells/mL 的Hela 細(xì)胞懸浮液接種96 孔培養(yǎng)板，取三瓶細(xì)胞分別接種于三個(gè)96 孔培養(yǎng)板，每個(gè)孔加入100 μL 細(xì)胞液。一個(gè)培養(yǎng)板用3 種藥品，每種藥品有5 個(gè)濃度，每一個(gè)濃度5 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置5 個(gè)空白對(duì)照孔。三個(gè)培養(yǎng)板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中48 h，使孔板中細(xì)胞生長狀態(tài)同步，培養(yǎng)期間有換液步驟。48 h 后，向培養(yǎng)板中分別加入200 μL 濃度分別為50、100、200、400、800 μg/mL的菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu。其中5-Fu 作為陽性對(duì)照，另外加入200 μL 培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，分別培養(yǎng)12、24、48 h。達(dá)到適當(dāng)時(shí)間后移除孔板中的培養(yǎng)基，加入100 μL 新鮮培養(yǎng)基，避光加入10 μL CCK-8 試劑，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h，用酶標(biāo)儀于450 nm 條件下讀數(shù)，測出OD 值。按照以下計(jì)算公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：細(xì)胞增殖抑制率其中，OD實(shí)驗(yàn)組值：菱角殼黃酮提取物或5-Fu 處理孔的OD 值；OD對(duì)照組值：無藥物處理孔的OD 值。

根據(jù)不同樣品不同濃度對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖抑制率，選擇抑制率在50%左右的濃度范圍，進(jìn)一步試驗(yàn)得出半抑制質(zhì)量濃度，即IC50值。以樣品濃度作為橫坐標(biāo)，抑制率IC%為縱坐標(biāo)，作線性回歸方程，分別計(jì)算菱角殼黃酮粗提物、純化物，以及5-Fu 作用12、24、48 h 的IC50值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中，單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組樣品平行次數(shù)與測試平行次數(shù)均為3次，而CCK-8 法測定菱角殼黃酮對(duì)Hela 細(xì)胞增殖抑制作用的實(shí)驗(yàn)中，均復(fù)孔5次，以均值表示最終結(jié)果。利用Excel 2020、SPSS16.0、Design ExpertV8.0.6.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)菱角殼黃酮得率的影響 如圖1所示，在實(shí)驗(yàn)組中，提取時(shí)間為30 min 時(shí)菱角殼黃酮得率最高為3.04%。當(dāng)提取時(shí)間小于30 min 時(shí)，菱角殼黃酮提取得率隨著提取時(shí)間的增加而上升成，而后，隨著提取時(shí)間增加，菱角殼黃酮得率會(huì)隨之下降。原因可能是提取時(shí)間過長，使得原料中的其他醇溶性物質(zhì)被溶解，進(jìn)而導(dǎo)致雜質(zhì)增加，使得黃酮提取率下降。因此，選擇提取時(shí)間10、30、50 min 作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。提取時(shí)間的變化對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響極顯著（P＜0.01），以上結(jié)果表明提取時(shí)間對(duì)菱角殼黃酮得率有影響。

圖1 提取時(shí)間對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on the extraction yield of water chestnut flavonoids

2.1.2 料液比對(duì)菱角殼黃酮得率的影響結(jié)果分析如圖2所示，在實(shí)驗(yàn)組中，料液比為1:30 g/mL 時(shí)菱角殼黃酮提取效果最佳，此時(shí)的菱角殼黃酮得率為3.13%。料液比超過1:30 g/mL 之后，菱角殼黃酮得率呈下降趨勢。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是溶劑用量少時(shí)，提取不夠充分，但隨著溶劑增多，其它雜質(zhì)的溶出率也會(huì)增大。因此，選擇料液比1:20、1:30、1:40 g/mL 作為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。料液比的變化對(duì)菱角殼黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），以上結(jié)果表明料液比對(duì)菱角殼黃酮得率有影響。

圖2 料液比對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響Fig.2 Effect of the ratio of material to liquid on the extraction yield of water chestnut flavonoids

2.1.3 乙醇濃度對(duì)菱角殼黃酮得率的影響結(jié)果分析由圖3所示，在實(shí)驗(yàn)組中，乙醇濃度為50%時(shí)菱角殼黃酮提取得率最高為3.20%。當(dāng)乙醇的濃度超出50%時(shí)，菱角殼中總黃酮得率與乙醇濃度成反比。原因可能是乙醇濃度過高，某些醇溶性雜質(zhì)和脂溶性物質(zhì)的溶出率會(huì)增大，使黃酮類物質(zhì)的溶出受到影響，從而造成菱角殼黃酮的提取率下降。因此，選擇乙醇濃度40%、50%、60%作為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素水平。乙醇濃度的變化對(duì)菱角殼黃酮得率的影響極顯著（P＜0.01），以上結(jié)果表明乙醇濃度對(duì)菱角殼黃酮得率有影響。

圖3 乙醇濃度對(duì)菱角殼黃酮提取得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of water chestnut flavonoids

2.1.4 提取溫度對(duì)菱角殼黃酮得率的影響結(jié)果分析如圖4所示，在實(shí)驗(yàn)組中，提取溫度為60 ℃時(shí)，菱角殼黃酮提取效果最佳，對(duì)應(yīng)總黃酮提取率為3.11%。當(dāng)提取溫度變化時(shí)，40、50、70 ℃處理，以及60、70 ℃處理之間對(duì)于菱角殼黃酮提取得率的影響差異并不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明提取溫度對(duì)菱角殼黃酮提取得率沒有影響，因此在進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)可以舍去對(duì)該因素的討論，固定提取溫度為60 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)菱角殼總黃酮提取得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids from water chestnut shell

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)Design Expert 軟件提供的模型，選取提取時(shí)間（X1，min）、料液比（X2，g/mL）、乙醇的濃度（X3，%）為變量因素，設(shè)定響應(yīng)值為菱角殼總黃酮得率（Y，%），響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回歸模型建立及方差分析 通過Design-Expert軟件進(jìn)行回歸分析得到回歸方程：Y=-9.77070+0.11095X1+161.07200X2+0.34237X3-0.10900X1X2+1.36250E-004X1X3-0.80800X2X3-2.07225E-表3所示，模型P＜0.0001，達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P＞0.05，表示方程擬合度良好。方差分析的結(jié)果表明提取時(shí)間、料液比和乙醇濃度對(duì)菱角殼黃酮得率的影響均極顯著（P＜0.01）。P（X1X2）＞0.05、P（X1X3）＞0.05、P（X2X3）＜0.01，由此證明，料液比（X2）和乙醇濃度（X3）的交互作用對(duì)菱角殼黃酮得率的影響顯著，其余交互作用的影響不顯著。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

2.2.3 兩兩因素交互作用分析 為了使結(jié)果更直觀，做出三維空間圖進(jìn)行進(jìn)一步的分析：響應(yīng)面坡度越陡峭，表明響應(yīng)值對(duì)于條件的改變?cè)矫舾校撘蛩貙?duì)菱角殼黃酮得率的影響越大；反之則表明該因素對(duì)菱角殼黃酮得率的影響越小。如圖5所示，在各因素兩兩交互作用對(duì)總黃酮得率的影響中，提取時(shí)間與料液比的交互作用顯著，提取時(shí)間與乙醇濃度、料液比與乙醇濃度的交互作用對(duì)菱角殼黃酮得率的影響不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。

圖5 各因素兩兩交互作用對(duì)總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of the interaction of various factors on the yield of total flavonoids

2.2.4 優(yōu)化工藝的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 通過 Design-Expert 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化菱角殼黃酮提取工藝的條件，結(jié)果顯示最佳提取工藝：提取時(shí)間27.65 min、料液比1:33.33 g/mL、乙醇濃度53.13%，對(duì)應(yīng)的總黃酮得率為3.512%。為了實(shí)際操作可行，將最佳工藝條件修正為：提取時(shí)間28 min、料液比1:33 g/mL、乙醇濃度53%，對(duì)應(yīng)的總黃酮得率為3.512%，對(duì)該工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次，得到菱角殼總黃酮得率為3.455%±0.16%。實(shí)際值與模型預(yù)測值相近，表明該模型具有一定的可行性。

2.3 菱角殼黃酮對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響

2.3.1 不同藥物不同條件對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的影響根據(jù)不同濃度、不同作用時(shí)間的菱角殼黃酮粗提物溶液、菱角殼黃酮純化物溶液、5-Fu 溶液對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制率，評(píng)價(jià)菱角殼黃酮對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖抑制效果。5-Fu，即胸苷酸合成酶抑制藥，是尿嘧啶5 位上的氫被氟取代的衍生物。5-Fu 在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶脫氧核苷酸（5F-dUMP），而抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸（dUMP）甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣剀账幔╠TMP），從而影響DNA 的合成。此外，5-FU 在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶核苷，以偽代謝產(chǎn)物形式摻入RNA 中干擾蛋白質(zhì)的合成，從而干擾細(xì)胞增殖，可作為陽性對(duì)照。

根據(jù)表4可知菱角殼黃酮粗提物、純化物均對(duì)Hela 細(xì)胞具有抑制作用，這種抑制作用在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，均弱于陽性對(duì)照5-Fu。同時(shí)，菱角殼提取物對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用與提取物的濃度、作用時(shí)間均呈正相關(guān)，會(huì)隨著作用時(shí)間的增加或作用濃度的升高而增長。本文中的實(shí)驗(yàn)組參數(shù)范圍內(nèi)，并未出現(xiàn)高濃度或長時(shí)間抑制作用。此外，藥物濃度低至50 μg/mL 時(shí)，作用相同時(shí)間，5-Fu 抑制率＞菱角殼黃酮粗提物抑制率＞菱角殼黃酮純化物溶液抑制率，；當(dāng)藥物濃度在100～800 μg/mL 時(shí)，5-Fu 溶液抑制率＞菱角殼黃酮純化物抑制率＞菱角殼黃酮粗提物溶液抑制率。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，低濃度的菱角殼黃酮對(duì)于Hela 細(xì)胞的毒性作用不明顯，需要濃度累積，并且由于其對(duì)于微生物的抑制作用反而會(huì)為Hela 細(xì)胞提供更好的生長環(huán)境。黃酮類物質(zhì)對(duì)于Hela 細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒性，可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡來抑制其增殖。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道[40-41]，大多數(shù)情況下這種抑制作用，有一定的濃度依賴，與本文的研究結(jié)果一致。

表4 不同藥物不同條件下對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用Table 4 Inhibitory effects of different drugs on the growth of Hela cells under different conditions

2.3.2 不同藥物抑制Hela 細(xì)胞的IC50值 IC50值[42-43]（half maximal inhibitory concentration）是指示某一物質(zhì)（主要指抑制劑）或者藥物在抑制某些生物程序的時(shí)半量。在凋亡方面，可以理解為一定濃度的某種藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率達(dá)到50%，該濃度稱為50%抑制濃度，即凋亡細(xì)胞與全部細(xì)胞數(shù)之比等于50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度。IC50值可以用來衡量藥物誘導(dǎo)凋亡的能力，即誘導(dǎo)能力越強(qiáng)，該數(shù)值越低。

根據(jù)表5可知隨著作用時(shí)間的增加，菱角殼黃酮粗提物、純化物、5-Fu 的IC50值逐漸下降，則進(jìn)一步證明在已驗(yàn)證的48 h 處理時(shí)間內(nèi)，菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu 對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖抑制作用均有時(shí)間依賴性，呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。同時(shí)，以作用時(shí)間達(dá)到48 h 為例，菱角殼黃酮粗提物、菱角殼黃酮純化物、5-Fu 的IC50值分別為：271.46、268.16、152.09 μg/mL。菱角殼黃酮純化物IC50值低于菱角殼黃酮粗提物，同時(shí)，菱角殼黃酮粗提物、純化物的IC50值均高于5-Fu。進(jìn)一步驗(yàn)證說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，菱角殼黃酮純化物對(duì)Hela 細(xì)胞的增殖抑制作用高于菱角殼粗提物，菱角殼提取物對(duì)Hela 細(xì)胞的抑制作用均弱于陽性對(duì)照5-Fu。且，不同藥物對(duì)Hela 細(xì)胞IC50值得影響差異顯著（P＜0.05）。

表5 不同藥物對(duì)Hela 細(xì)胞增殖抑制作用的IC50 值Table 5 Inhibitory effect of purified water chestnut shell flavonoids on the growth of Hela cells

3 結(jié)論

以菱角殼黃酮粗提物中的總黃酮提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化所得最佳工藝參數(shù)為：提取時(shí)間28 min、料液比1:33 g/mL、乙醇濃度53%。在該條件下，菱角殼黃酮的提取率為3.455%±0.16%。其中，提取溫度對(duì)最終得率的影響不顯著（P＞0.05），提取時(shí)間、料液比、乙醇濃度對(duì)于最終結(jié)果的影響均極顯著（P＜0.01）。兩兩交互，僅提取時(shí)間與料液比的交互作用對(duì)最終菱角殼黃酮粗提物中的總黃酮提取得率影響極顯著（P＜0.01）。通過此工藝提取所得菱角殼黃酮粗提物，以及經(jīng)過進(jìn)一步分離純化的菱角殼黃酮純化物均能夠有效抑制Hela 細(xì)胞的增殖，說明菱角殼黃酮提取物具有一定的抗腫瘤活性。結(jié)合抑制率的變化趨勢可知，菱角殼黃酮提取物抑制Hela 細(xì)胞活性對(duì)濃度和作用時(shí)間有依賴性。在一定范圍內(nèi)，其抑制作用與提取物濃度和作用時(shí)間均呈正相關(guān)。菱角殼作為菱角生產(chǎn)企業(yè)的下腳料，每年產(chǎn)量頗多，直接丟棄會(huì)造成了較大的資源浪費(fèi)。本研究可以對(duì)菱角殼以及其它類似的農(nóng)副產(chǎn)品資源開發(fā)利用提供參考。