響應面法優(yōu)化元寶楓籽粕酶解工藝及多肽功能特性研究

畢曉娟，魏 亮，楊慧瑩，于欣馨，蒲鐸文，路 祺, ，祖元剛

（1.東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院，黑龍江哈爾濱 150040；2.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

元寶楓（Acer truncatumBunge.）又名元寶槭，隸屬于槭樹科槭樹屬[1-2]，是一種落葉喬木，主要分布在吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、河北、山西、山東、陜西、及甘肅等地區(qū)。作為我國特有的食用木本油料樹種，元寶楓籽仁含油率為42.6%[3]，元寶楓籽油富含神經(jīng)酸[4]，被認為是一種優(yōu)良的食用油[5]，其籽仁中蛋白質(zhì)含量也僅次于大豆[6]。衛(wèi)生部已于2011 年3 月將元寶楓籽油列入新的資源食品[7]。目前，我國元寶楓種植面積已超過4×104公頃[8]，每年籽粒產(chǎn)量約為30×104噸，如果將全部種仁用于生產(chǎn)籽油，每年可產(chǎn)生19.5×104噸左右的元寶楓籽粕剩余物。元寶楓籽粕剩余物不僅蛋白質(zhì)含量高（52%），而且所含蛋白為不含淀粉的完全蛋白質(zhì)。當前關于元寶楓的開發(fā)研究還主要集中在油的提取、食用、保健，以及藥理特性方面[9-11]。對于元寶楓籽粕剩余物應用的研究甚少，僅僅有少量應用于釀制醬油、生產(chǎn)飼料、肥料等[12-14]，大部分被堆棄，這就造成了嚴重的資源浪費和環(huán)境污染。因此，元寶楓籽粕開發(fā)利用研究迫在眉睫。

多肽是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，與蛋白質(zhì)相比，其轉(zhuǎn)換后的多肽具有分子量小，利于人體吸收和較強的生理活性等優(yōu)點[15]。通常制備多肽的方法有：生物提取法[16-17]、微生物發(fā)酵法[18-19]、合成法[20-21]、化學法[22]和酶解法[23]等。Fu 等[24]利用高氯酸從牛肉中提取內(nèi)源性活性肽，由于提取流程復雜，難度比較大，投入成本高，活性肽產(chǎn)量少，不能滿足人們的需求[25]，因而不具備實際生產(chǎn)價值；王文江等[26]利用黑曲霉發(fā)酵法制備山杏多肽，微生物發(fā)酵法雖然具有繁殖速度快，生長周期較短等優(yōu)勢，但很多的產(chǎn)酶菌有毒或?qū)θ梭w有害，目前已經(jīng)證明無毒，可以用于食品開發(fā)的菌種并不多，安全問題、作用機理成為阻礙微生物發(fā)酵法制備活性肽的最大障礙；Yu 等[27]采用固相多肽合成的方法，先確定目標肽段中氨基酸的組成及排列順序，然后分步合成抗癌生物活性肽。但該方法存在副反應多，不易控制，產(chǎn)生的肽活性低，多樣性差等缺點?；瘜W方法是用酸或堿水解，酸堿水解雖然簡單，成本低，但不易控制生產(chǎn)，生產(chǎn)條件較苛刻，所獲氨基酸營養(yǎng)價值有所降低，目前此方法很少采用[28-29]。酶解法是近年來發(fā)展比較快的一種獲取生物活性肽的方法，它具有穩(wěn)定性好、可操作性強、反應條件比較溫和、多肽制備效率高、周期短、安全性高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點。安兆祥等[30]采用堿性蛋白酶提取黑木耳蛋白，所提取的黑木耳蛋白具有較好的溶解性、乳化性、乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性。程贊等[31]采用堿性蛋白酶對核桃分離蛋白進行酶解，發(fā)現(xiàn)酶解后所獲得的核桃分離蛋白吸水性、吸油性、溶解性、乳化性和起泡性有了明顯改善。綜上所述，酶解法的應用更為廣泛，發(fā)展前景更好。

目前，關于元寶楓籽粕酶解工藝及其多肽功能特性方面的研究較少。本研究采用堿性蛋白酶酶解法制備元寶楓籽粕酶解多肽。通過單因素實驗和Box-Behnken 中心組合試驗設計，確定了元寶楓籽粕酶解多肽的最優(yōu)制備工藝條件。并對元寶楓籽粕酶解多肽進行氨基酸成分分析和功能特性測定，以期為元寶楓籽粕酶解多肽的提取和高值化利用提供數(shù)據(jù)和理論支撐。減少廢棄物對環(huán)境污染同時，也對資源進行了合理利用，具有重要的經(jīng)濟意義和生態(tài)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

元寶楓籽粕 陜西金旺農(nóng)林科技有限公司；8-苯胺基-1-萘磺酸鈉（ANS） 上海麥克林生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS） 天津百倫斯生物技術有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg） 上海源葉生物科技有限公司；大豆色拉油 九三糧油工業(yè)集團有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

多功能粉碎機（QJ-20） 上海兆申科技有限公司；紫外-可見光分光光度計（UV-5500） 上海元析儀器有限公司；熒光分光光度計（F-700） 天美（中國）科學儀器有限公司；電子調(diào)溫加熱套（98-1-B）天津市泰斯特儀器有限公司；高速電動勻漿器（FSHII） 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 將元寶楓籽粕機械粉碎，并使用40 目篩過濾，得到元寶楓籽粕粉，置于0～4 °C 冰箱封存供后續(xù)使用。脫油處理：按料液比1:10，石油醚回流提取時間4.0 h，重復提取3次，60 ℃烘干得到脫油后元寶楓籽粕粉末樣品。脫糖處理：按照料液比1:20 g·mL-1將脫油后的元寶楓籽粕粉末，沸水回流提取4.0 h，在8000 r·min-1下離心5 min，將離心后的沉淀于105 ℃烘箱中烘干，得到脫油脫糖粉，儲存在棕色干燥器中，供后續(xù)實驗使用。

1.2.2 堿性蛋白酶酶解多肽的制備 稱取一定質(zhì)量的脫油脫糖元寶楓籽粕粉121 ℃滅菌15 min 后，用氫氧化鈉和鹽酸將樣品溶液調(diào)整到適當pH，加入適量的堿性蛋白酶，預設環(huán)境下進行酶解，反應結束后，沸水浴中滅活15 min，在5000 r·min-1下離心10 min，取上清液裝于截留分子質(zhì)量為3000 Da 的透析袋中透析，每4 h 更換一次透析液，直至透析液pH 為中性不在發(fā)生變化為止，透析后溶液凍干，得到元寶楓籽粕粉酶解多肽，0～4 °C 低溫保存，用于后續(xù)實驗。酶解多肽得率（Y1）的計算公式如下：

式中：m1—凍干所獲得樣品質(zhì)量，g；c—凍干所獲得樣品中多肽的含量，%；m2—酶解前元寶楓籽粕（去油去糖）的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素實驗 固定料液比1:20 g·mL-1，加酶量3%，酶解溫度55 ℃，酶解體系pH10，酶解時間3 h，在上述工藝條件下，以酶解多肽得率為響應值，分別探討酶解時間（0.5、1、2、3、4 h）、加酶量（0.3%、1.5%、3%、15%、30%）、酶解溫度（25、40、55、70、85 ℃）、酶解體系pH（4、6、8、10、12）、料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g·mL-1）5 個因素對元寶楓籽粕酶解多肽得率的影響。每個實驗重復3次，取均值。

1.2.4 響應面法優(yōu)化酶解工藝 根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗的設計原理，在單因素實驗基礎上，以多肽得率為響應值，進行四因素三水平響應面分析試驗（見表1），四個因子分別為酶解時間（h）、加酶量（%）、酶解溫度（℃）和酶解體系pH，試驗總共設計29 個試驗點，其中包括5 個中心點用來驗證試驗誤差。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface test factors and levels

1.2.5 酶解多肽氨基酸組成分析 參照Jin 等[32]的方法，稱取一定量的酶解多肽樣品，加入6.0 mol/L HCl，氮氣保護下密封在玻璃管中，110 °C 水解24 h。使用超純水將過濾后的水解液稀釋至50.0 mL。取1.0 mL 溶液在45 ℃真空脫酸，再用5.0 mL 0.1 mol/L HCl 溶解。另外，進行色氨酸含量分析時，稱取一定量的酶解多肽樣品，4.0 mol/L LiOH 在氮氣保護下加入到聚四氟乙烯管中，110 ℃下水解24 h。水解產(chǎn)物過濾后，用6.0 mol/L 鹽酸中和至pH2.2。加入超純水，定容到100.0 mL。酶解多肽的氨基酸組成成分采用A300 氨基酸分析儀（德國）進行分析，依據(jù)不同氨基酸積峰面積和相應標準曲線來計算相應氨基酸含量，即C氨基酸=f（A氨基酸）。

1.2.6 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽功能特性的測定

1.2.6.1 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽溶解度 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽與水混合，用1.0 mol/L NaOH 和HCl 將混合物的pH 調(diào)節(jié)至2.0～12.0。室溫下攪拌30 min，5000 r·min-1離心5 min，通過凱氏定氮法[33]確定樣品中的總蛋白質(zhì)濃度和上清中的蛋白濃度，6.25 作為轉(zhuǎn)換因子。平行測定三次，并通過蛋白質(zhì)的濃度（%）與pH 作圖來獲得溶解度曲線。溶解度（P）的計算方法如下：

式中：W1—上清中蛋白的濃度，mg·mL-1；W2—樣品中總蛋白的濃度，mg·mL-1。

1.2.6.2 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽吸油性和吸水性 根據(jù)Monteiro 等[34]方法測定元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的吸油性或吸水性。稱0.5 g元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽，于離心管中。緩慢向離心管中加入5 mL 的大豆油或超純水，渦旋振蕩器充分振蕩混勻后，室溫靜置0.5 h 后，5000 r·min-1離心10 min，準確測量上清液體積。以每克樣品吸附油或水的體積來評估其吸油性或吸水性。

1.2.6.3 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽乳化性及乳化穩(wěn)定性 根據(jù)Pearce 等[35]的方法對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的乳化特性進行測定。用乳化活性指標（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ES）評估元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的乳化活性。準確稱取100 mg 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽，分散于100 mL 的蒸餾水中，置于渦旋振蕩器上室溫振蕩溶解，用1.0 mol/L NaOH 和HCl 調(diào)節(jié)酶解多肽溶液pH 為2、4、6、8、10，加入15 mL 大豆油10000 r·min-1室溫勻漿2 min。用移液器在0 和5 min 時迅速從容器底部取樣50 μL 乳狀液置于10 mL 離心管中，再加入4.95 mL 的SDS（0.1%）溶液，渦旋振蕩器振蕩混勻30 s。在500 nm 的條件下，測定樣品的吸光值。乳化活性指標（EAI）和乳化穩(wěn)定性（ES）的計算方法如下：

式中：N—稀釋倍數(shù)；C—蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)（g·mL-1）； φ—混合體系油的體積分數(shù)；A0—0 min 時乳化液的吸光值；A5—5 min 后乳化液的吸光值；△t—5 min。

1.2.6.4 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡穩(wěn)定性 根據(jù)Booma 等[36]的方法對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡穩(wěn)定性進行測定。稱取一定質(zhì)量的元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽樣品，用蒸餾水將其配制成濃度為50 mg·mL-1溶液。取10 mL 樣品溶液，調(diào)節(jié)pH 為2、4、6、8、10，10000 r·min-1高速均漿3 min。將酶解多肽溶液移到量筒中，測量此時的泡沫體積（記為V），在室溫靜置，并間隔不同的時間（0、5、10、20、30 min）測量此時泡沫的體積（記為V1）。起泡性（FC）和起泡穩(wěn)定性（FS）的計算公式如下：

式中：V—在0 min 時溶液的氣泡體積，mL；V1—在5、10、20、30 min 時的泡沫體積，mL。

1.2.6.5 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽表面疏水性 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的表面疏水性通過熒光探針（ANS）的方法進行測定[37-38]。10 mg 酶解多肽樣品懸浮在10 mL 磷酸緩沖液中（0.01 mol/L，pH7），250 r·min-1低速攪拌2 min，通過磷酸緩沖液將酶解多肽樣品溶液對半稀釋成不同濃度。取4 mL酶解多肽溶液，加入 20 μL 8 mmol/L 的ANS（用0.01 mol/L PBS 溶液配置）溶液后，混勻、避光靜置5 min 后10000 r·min-1離心5 min，取上清液用熒光光度計測定酶解多肽樣品的熒光強度 （Fluorescenceintensity，F(xiàn)I）。設置酶解多肽樣品的激發(fā)波長、發(fā)射波長、狹縫寬度分別為287、352、5 nm，圖像自變量為酶解多肽的濃度，因變量為熒光強度（FI），初始斜率為酶解多肽的表面疏水性指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Design-Expert 10.0.1 軟件進行Box-Behnken試驗設計及響應面試驗數(shù)據(jù)處理，并對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析及二次多項式回歸擬合。每組實驗數(shù)據(jù)設置3 個平行，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤差來表示，采用Excel 和Origin 2018.0 進行數(shù)據(jù)和圖像處理并生成圖片。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 酶解時間對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響 在其他因素固定條件下，比較不同酶解時間對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響（見圖1A）?？梢钥闯觯獙殫髯哑蓧A性蛋白酶酶解多肽得率隨著酶解時間的不斷延長表現(xiàn)為先上升的趨勢，在3 h 時到達峰值，而后趨勢逐漸下降。因此，選擇酶解時間為3 h。

2.1.2 加酶量對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響 同樣固定其他反應條件不變，比較不同加酶量對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響（見圖1B）?？梢钥闯?，隨著堿性蛋白酶用量的增加，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率表現(xiàn)為先急劇增加的趨勢，而后趨于平緩，即當堿性蛋白酶用量超過3%時，元寶楓籽粕堿性蛋白酶的多肽得率變化不明顯。因此，考慮到加工成本，選擇加酶量3%。

2.1.3 pH 對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響 同樣固定其他反應因素不變，比較不同pH 對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響（見圖1C）。從圖可以看出，隨著溶液體系pH 逐漸升高，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率也逐漸增加。當溶液體系pH 超過10 時，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率略有降低。這是過量的堿影響了酶分子的特殊構象，使堿性蛋白酶的活性受到抑制。因此，溶液體系pH 選為10。

2.1.4 酶解溫度對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響 同樣固定其他反應因素不變，比較不同酶解溫度對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。而當反應溫度高于55 ℃時，隨著反應溫度的增加，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。因此，酶解溫度選定為55 ℃。

2.1.5 料液比對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響 同樣固定其他反應因素不變，比較不同料液比對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響（見圖1E）。增加料液比，元寶楓籽粕堿性蛋白酶解多肽得率急劇增加。當料液比超過1:20 （g·mL-1）時，元寶楓籽粕堿性蛋白酶解多肽得率趨于平緩，多肽得率增加不明顯。因此，選擇料液比為1:20（g·mL-1）。

圖1 各個單因素對多肽得率的影響Fig.1 Effect of each single factor on polypeptide yield

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 回歸方程與檢驗 對表2 酶解多肽得率（Y）的實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合后，得到元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的酶解多肽得率對pH（A）、加酶量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）各因素變量的多元二次回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及試驗結果Table 2 Response surface test design and test results

如表3所示，對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率來說，模型F值為107.95（P＜0.01），說明該模型顯著性良好，失擬項（P=0.4267＞0.05）不顯著，說明回歸模型擬合程度良好。其中，R2=0.9908，單因素變量可以解釋99.08%的響應值變化。模型一次項A、B 和C，交互項CD 和二次項A2、B2、C2、D2對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的影響極顯著（P＜0.01），如表4所示，校正系數(shù)R2Adj=0.9816，表明僅有總變量的1.84%不能用此模型來解釋，R2與R2Adj二者之差小于0.2，更加驗證回歸方程和實驗結果一致性較高。變異系數(shù)（CV）為1.44%（＜5%），信噪比35.974（＞4），均表明該回歸方程精度和可信性比較高，可以用該模型分析并確定制備元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的最佳工藝參數(shù)。

表3 響應面回歸模型及方差分析結果Table 3 Response surface regression model and analysis of variance results

表4 回歸方程的可信度分析Table 4 Reliability analysis of regression equation

2.2.2 響應面曲面分析 酶解時間、酶解溫度、溶液體系pH、加酶量對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率影響的三維立體圖以及等高線圖（如圖2）。由圖可知，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率與4 個因素的三維立體圖拋物面的開口均向下，有最大值，等高線圖近似呈橢圓形，各個因素之間存在交互作用，由圖2k可知，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率隨著酶解時間和酶解溫度增大呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，等高線圖（如圖2l）較為密集，圖形接近橢圓形，說明酶解時間和酶解溫度交互作用對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率影響顯著。根據(jù)系數(shù)估計值絕對值的大小，4 個因素對多肽得率的影響大小依次為：C（酶解時間）＞B（加酶量）＞A（pH）＞D（酶解溫度）。

圖2 各因素交互作用對多肽得率影響的響應面圖Fig.2 Response surface diagram of the interaction of various factors on the yield of peptides

2.2.3 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽最優(yōu)工藝條件驗證 由Design Expert 10.0.1 軟件分析，得到最優(yōu)的工藝條件為：酶解時間為3.30 h，加酶量為3.01%，酶解溫度為52.29 ℃，pH 為10.25，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率的預測值為40.2682%。考慮實際的操作性，對工藝參數(shù)進行調(diào)整：酶解時間為3.30 h，加酶量為3%，酶解溫度為55 ℃，pH 為10。進行3次驗證實驗，最后實際酶解多肽得率為40.13%±0.15%，與預測值相差0.1382。較為接近，表明優(yōu)化的試驗條件較為可信，具有實際應用價值。

2.3 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽氨基酸組成分析

元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的氨基酸組成分析如圖3A。從圖可以看出，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽中所檢測到的十八種氨基酸含量均高于原料，其中含量最高的是谷氨酸（Glu）（8.096%），然后是脯氨酸（Pro）（5.719%）和亮氨酸（Leu）（4.731%），這表明經(jīng)過堿性蛋白酶處理后元寶楓籽粕的多肽含量有了很大程度的提高，這也與核桃多肽的氨基酸組成具有相似性[39]，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值為0.6238，高于大豆蛋白（0.4804）[40]。元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽所含八種必需氨基酸的含量高達20.3%，遠高于國際糧農(nóng)組織所建議成人所需必需氨基酸的量（10.75%）[41]。另外，除不含有谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn），元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽含有其他全部十二種非必需氨基酸。通過對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽氨基酸的增量進行分析（見圖3B），可以看出經(jīng)過堿性蛋白酶酶解處理后，氨基酸增量最大的為脯氨酸（Pro），其次是谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）和亮氨酸（Leu）。其中，脯氨酸不僅可以有效清除自由基，還可用于營養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)缺乏癥和胃腸道疾病治療[42]，谷氨酸屬于呈味氨基酸的一種[43]，蘇氨酸和亮氨酸屬于人體八種必需氨基酸，這些都表明元寶楓籽粕經(jīng)過堿性蛋白酶后所獲得的酶解多肽具有更高的營養(yǎng)價值。

圖3 氨基酸圖Fig.3 Amino acid diagram

2.4 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的溶解度

元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽溶解度受溶液體系pH 的影響比較明顯（如圖4），在pH 為2～12 范圍內(nèi)，元寶楓堿性蛋白酶酶解多肽的溶解度圖形呈“V”形，pH 為4 時溶解度最小。這與王性炎等[44]報道的在等電點處溶解度較低的結果相似，隨著pH從4 逐漸增加到10，元寶楓堿性蛋白酶酶解多肽的溶解度逐漸增大，這可能是因為在堿性環(huán)境條件下，蛋白質(zhì)分子和水之間的相互作用增大，從而導致溶解度的增大。在茶籽多肽[45]中也觀察到類似的pH 溶解度曲線。

圖4 多肽的溶解度Fig.4 Solubility of peptides

2.5 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽吸水性和吸油性

吸水性和吸油性用來表示多肽分子與水（油）相的結合能力。元寶楓堿性蛋白酶酶解多肽的吸水性為2.02 mL/g（即2.02 g/g）與冷榨大豆餅粉的吸水性（2.27 g/g）較為接近，吸水性在食品加工過程中對食品的黏性，可塑性以及樣品流動性具有很大的影響。Aletor 等報道建議蛋白質(zhì)的持水性在1.49 到4.72 g/g范圍內(nèi)就可以應用在有一定粘性的食品中[46]。元寶楓堿性蛋白酶酶解多肽吸油性為4.95 mL/g（即4.553 g/g）要高于大豆蛋白的吸油性（2.61 g/g）[47]，蛋白質(zhì)的吸油性是影響食品風味的保留，具有延長保質(zhì)期的功能特性[48]。因此，元寶楓堿性蛋白酶酶解多肽可以作為食品中的一種潛在的功能成分，如烘焙型產(chǎn)品和乳液型食品。

2.6 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽乳化性和乳化穩(wěn)定性

蛋白質(zhì)乳化性是指蛋白質(zhì)能夠使油和水之間形成乳狀液的能力，而在一定時間內(nèi)，維持乳狀液分散體系穩(wěn)定而不破碎的能力稱為乳化穩(wěn)定性。由圖5可知，隨著溶液體系pH 的不斷變化，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的乳化性和乳化穩(wěn)定性也不斷變化。當溶液體系pH4 時，多肽的乳化性較小，原因可能是pH4 臨近蛋白質(zhì)等電點，此處靜電荷較少，導致元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽聚集形成沉淀，溶解度較低，乳化性較低。酶解多肽的乳化性及乳化穩(wěn)定性隨著pH 增加（4～10）而逐漸增強。堿性環(huán)境下，酶解多肽所帶負電荷對多肽在水油界面乳狀液的形成更加有利[49]。另外，酶解多肽在堿性環(huán)境下，較高的溶解度有利于增大水油間相互作用力，使酶解多肽乳化活性增加[50]。元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽乳化性和乳化穩(wěn)定性略低于大豆分離蛋白乳化性和乳化穩(wěn)定性[51]。

圖5 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的乳化性和乳化穩(wěn)定性Fig.5 Emulsifying property and emulsifying stability of polypeptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal

2.7 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡穩(wěn)定性

從圖6A 能夠看出，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的起泡性在pH4 時較低，這是因為在臨近等電點時，酶解多肽的溶解度比較低，溶液中較低的多肽濃度導致形成泡沫的數(shù)量比較少，不利于多肽分子在界面形成剛性膜[52-55]。隨著pH 的增加，酶解多肽的起泡性逐漸增強，這主要是因為酶解多肽的溶解度隨著溶液體系pH 的增大而逐漸增加，且在pH10時起泡性達到最大值。而元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽的起泡穩(wěn)定性呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢（見圖6B），這是由于隨著pH 的增大，酶解多肽的溶解度增加，增強分子間的作用，形成的泡沫的穩(wěn)定性也增強[56]，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽起泡性低于大豆酶解分離蛋白，其起泡穩(wěn)定性與大豆酶解分離蛋白相當[57]。

圖6 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽起泡性和起泡穩(wěn)定性Fig.6 Foaming property and foaming stability of polypeptides hydrolyzed by alkaline protease from Acer truncatum seed meal

2.8 元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽表面疏水性

元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽表面疏水性主要反映的是多肽分子疏水集團的暴露程度，可以用來表征多肽的分子構象及其穩(wěn)定性。實驗結果表明元寶楓籽粕堿性蛋白酶解多肽的表面疏水性為1365.3，這與范麗麗等[58]的研究以微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶素交聯(lián)處理大豆7S 球蛋白的表面疏水性結果相似。

3 結論

本研究以元寶楓籽粕剩余物為原料，通過堿性蛋白酶酶解方式獲得酶解多肽，在單因素實驗的基礎上，采用響應面優(yōu)化法對酶解工藝進行優(yōu)化，獲得了最優(yōu)制備工藝條件。在最優(yōu)制備工藝條件下元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽得率與理論值接近，響應面模型準確可靠，具有實際應用價值。

通過對元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽氨基酸成分分析，酶解多肽中所含八種必需氨基酸的含量遠高于國際糧農(nóng)組織所建議成人所需必需氨基酸的含量。除了不含有谷氨酰胺（Gln）和天冬酰胺（Asn），酶解多肽含有其他全部十二種非必需氨基酸。經(jīng)過堿性蛋白酶酶解處理后，氨基酸增量最大的為脯氨酸（Pro），其次是谷氨酸（Glu）、蘇氨酸（Thr）和亮氨酸（Leu），這些都表明元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽具有較高的營養(yǎng)價值。另外，元寶楓籽粕堿性蛋白酶酶解多肽具有一定的吸水性和吸油性，可作為一種潛在的功能成分應用于食品中。

元寶楓籽油已經(jīng)列入新資源食品，目前關于元寶楓的開發(fā)研究主要集中在元寶楓籽油方面，而對于元寶楓籽油加工剩余物方面的研究甚少，元寶楓籽粕的開發(fā)利用研究迫在眉睫。本研究將為元寶楓籽粕開發(fā)應用提供數(shù)據(jù)和理論支撐，有助于發(fā)現(xiàn)元寶楓籽粕新的潛在應用，為元寶楓籽仁的高值化利用奠定了基礎。元寶楓籽仁蛋白屬于全價蛋白，不含淀粉，可針對特殊人群開發(fā)成食品，用于糖尿病人、營養(yǎng)不良、蛋白質(zhì)缺乏癥和胃腸道疾病治療。未來還需對元寶楓籽粕酶解多肽體外、體內(nèi)生理活性以及作用機制進行深入的研究，開發(fā)一些功能性產(chǎn)品。最終實現(xiàn)元寶楓籽粕剩余物的綜合利用率，提高資源的利用效率。