卡維地洛納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備與大鼠腸道吸收研究

王希文,汪 洋

武漢市紅十字會(huì)醫(yī)院藥劑科,武漢 430015

卡維地洛(carvedilol,CAR)為α1受體和β受體雙重阻滯劑,通過(guò)擴(kuò)張血管、減少外周阻力發(fā)揮降低血壓的作用,臨床用于高血壓、充血性心力衰竭和心絞痛的治療[1]。CAR 屬于生物制藥分類系統(tǒng)Ⅱ類藥物[2],其較差的溶解度限制了機(jī)體對(duì)藥物的吸收、利用,其口服生物利用度僅為20%～25%[3]。納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體(nanostructured lipid carriers,NLCs)具有有效控制藥物釋放、避免儲(chǔ)存過(guò)程中藥物泄漏、提高難溶性藥物的口服生物利用度[4]、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢(shì)[5]。本研究采用高壓均質(zhì)法制備CAR-loaded-NLCs,并通過(guò)大鼠原位灌注模型考察其在大鼠腸道中的吸收特征[6],為CAR 的二次開發(fā)、利用提供新的研究思路。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

FSH-2A 型可調(diào)高速勻漿機(jī)(常州市金壇友聯(lián)儀器研究所);APV-1000實(shí)驗(yàn)型高壓均質(zhì)機(jī)(上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);DF-101Q 型系列集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司);JEM-F200型場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社);Malvern Zetasizer Nano ZS90型納米粒徑電位分析儀(英國(guó)Malvern公司)。

1.2 試藥

卡維地洛(浙江華海藥業(yè)股份有限公司);雙硬脂酸甘油酯(precirol ATO 5)、單硬脂酸甘油酯(glycerin monostearate,GMS)、山崳酸甘油酯(compritol 888 ATO)、丙二醇二癸酸酯(labrafac PG)、肉豆蔻酸異丙酯(isopropyl myristate,IPM)和12-羥基硬脂酸聚氧乙烯酯(solutol HS-15)均由嘉法獅上海貿(mào)易有限公司惠贈(zèng);中鏈三酰甘油(medium chain triglycerides,MCT)、油酸乙酯(ethyl oleate,EO)、油酸(oelic acid,OA)均由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司惠贈(zèng);泊洛沙姆188(poloxamer 188)和吐溫80(Tween 80)、D-α-維生素E聚乙二醇琥珀酸酯(D-α-tocopherol polyethylene glycol 1000 succinate,TPGS)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL)和氫化聚氧乙烯蓖麻油(ethoxylated hydrogenated castor oil,RH 40)均由巴斯夫有限公司惠贈(zèng);其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 CAR-loaded-NLCs的制備工藝

用高壓均質(zhì)法制備CAR-loaded-NLCs[7]。將處方量的固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)混合后在85 ℃下加熱熔化;再將處方量的CAR 溶解到5 mL 體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇中,攪拌至藥物完全溶解,并加入上述油相中,85 ℃下?lián)]干乙醇,形成油溶液,備用;取處方量的表面活性劑加入一定量的熱水(85 ℃)中,攪拌至完全溶解,形成水溶液,備用;將水溶液加入油溶液中,并以20 000 r·min-1高速剪切10 min,得到乳白色渾濁液;再將上述溶液轉(zhuǎn)移到高壓均質(zhì)機(jī)中,在壓力為800 MPa 的條件下均質(zhì)5 次,得到CAR-loaded-NLCs,將樣品置于4 ℃儲(chǔ)存,備用。

2.2 粒徑分布和Zeta電位測(cè)定

用納米粒徑電位分析儀檢測(cè)CAR-loaded-NLCs的粒徑分布和Zeta電位,樣品用超純水稀釋50倍在25 ℃下測(cè)定,每組樣品測(cè)定3次,取平均值。

2.3 包封率測(cè)定

通過(guò)超濾離心法測(cè)定CAR-loaded-NLCs的包封率[8]。取CAR-loaded-NLCs 1 mL置于25 mL量瓶中,加入甲醇5 mL 并在水浴超聲中破乳,取上述溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量(C總);量取CAR-loaded-NLCs加入超濾離心管中,以4 000 r·min-1離心20 min,取超濾液經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾,進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量(C游離),計(jì)算包封率。

包封率=[1-C游離/(C總×25)]×100%

2.4 處方工藝研究

2.4.1 固體脂質(zhì)篩選 鑒于脂質(zhì)的種類會(huì)對(duì)NLCs的穩(wěn)定性、載藥能力、藥物釋放產(chǎn)生一定的影響[9],因此對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行篩選。分別選擇precirol ATO 5、GMS和compritol 888 ATO 作為固體脂質(zhì)制備CARloaded-NLCs,考察其對(duì)CAR-loaded-NLCs粒徑分布、PDI、Zeta電位和包封率的影響。結(jié)果見表1。由表1可見,用precirol ATO 5作為固體脂質(zhì)制備的CARloaded-NLCs粒徑最小,包封率最高。因此,本研究選用Precirol ATO 5作為固體脂質(zhì)。

表1 不同固體脂質(zhì)對(duì)粒徑分布、PDI、Zeta電位和包封率的影響 (n=3,)Tab.1 Influence of different solid lipids on particle size,PDI,Zeta potential and EE (n=3,)

表1 不同固體脂質(zhì)對(duì)粒徑分布、PDI、Zeta電位和包封率的影響 (n=3,)Tab.1 Influence of different solid lipids on particle size,PDI,Zeta potential and EE (n=3,)

2.4.2 液體脂質(zhì)篩選 液體脂質(zhì)對(duì)NLCs的載藥能力以及形成晶格缺陷結(jié)構(gòu)發(fā)揮關(guān)鍵作用[10],需要考察CAR 在不同液體脂質(zhì)中的表觀溶解度。將藥物分散到不同種類的液體脂質(zhì)中,并在(37±0.5) ℃搖床中以200 r·min-1振搖48 h,以3 000 r·min-1離心30 min,并用0.22 μm 濾膜過(guò)濾上清液。取上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量。結(jié)果見表2。由表2可見,CAR 在IPM 中的表觀溶解度為(34.5±1.4)mg·g-1,明顯高于OA 的(5.6±0.7) mg·g-1,EO的(12.6±0.5) mg·g-1,MCT的(22.9±1.1) mg·g-1,以及l(fā)abrafac PG 的(26.2±1.3) mg·g-1。因此,本研究選擇將IPM 作為液體脂質(zhì)。

表2 CAR 在不同液體脂質(zhì)中的表觀溶解度 (n=3,)Tab.2 Apparent solubility of CAR in various liquid lipids(n=3,)

表2 CAR 在不同液體脂質(zhì)中的表觀溶解度 (n=3,)Tab.2 Apparent solubility of CAR in various liquid lipids(n=3,)

2.4.3 表面活性劑種類篩選 合適的表面活性劑能夠有效減小NLCs的粒徑分布。表面活性劑覆蓋在疏水性納米粒表面,降低納米粒與水性介質(zhì)之間的表面張力,防止顆粒聚集或生長(zhǎng),提高其物理穩(wěn)定性[11]。分別選擇poloxamer 188、Tween 80、TPGS、solutol HS-15、ELP和RH 40 6種非離子表面活性劑,考察不同表面活性劑對(duì)CAR-loaded-NLCs粒徑分布和包封率的影響。結(jié)果見表3。由表3可見,用TPGS制備的CAR-loaded-NLCs為外觀呈半透明、泛淡藍(lán)色乳光的溶液,其粒徑最小,包封率較高。因此,本研究選擇將TPGS作為表面活性劑。

表3 不同表面活性劑對(duì)外觀、粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.3 Influence of different surfactants on appearance,particle size distribution and encapsulation efficiency (n=3,)

表3 不同表面活性劑對(duì)外觀、粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.3 Influence of different surfactants on appearance,particle size distribution and encapsulation efficiency (n=3,)

2.4.4 固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)比例篩選 選擇precirol ATO 5和IPM 的質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1制備不同批次的CAR-loaded-NLCs,考察precirol ATO 5和IPM 的質(zhì)量比對(duì)粒徑分布和包封率的影響。結(jié)果見表4。由表4可見,當(dāng)precirolATO 5和IPM 的質(zhì)量比為2∶1時(shí),未觀察到脂質(zhì)分層現(xiàn)象,以該比例制備的CAR-loaded-NLCs粒徑較小,包封率最高。因此,本研究選擇以precirol ATO 5和IPM的質(zhì)量比為2∶1制備CAR-loaded-NLCs。

表4 固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)比對(duì)粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.4 Influence of different ratios of solid lipid and liquid lipid on the particle size and EE (n=3,)

表4 固體脂質(zhì)與液體脂質(zhì)比對(duì)粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.4 Influence of different ratios of solid lipid and liquid lipid on the particle size and EE (n=3,)

2.4.5 藥物與脂質(zhì)質(zhì)量比篩選 選擇藥物和脂質(zhì)的質(zhì)量比分別為0.01∶1、0.02∶1、0.03∶1、0.04∶1和0.05∶1制備不同批次的CAR-loaded-NLCs,考察其對(duì)粒徑分布和包封率的影響。結(jié)果見表5。由表5可見,藥物和脂質(zhì)質(zhì)量比對(duì)粒徑影響不明顯,但是會(huì)影響藥物的包封率,隨著藥物和脂質(zhì)質(zhì)量比的增大,包封率出現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),當(dāng)藥物和脂質(zhì)質(zhì)量比為0.02∶1時(shí),包封率最高。因此,本研究選擇藥物和脂質(zhì)質(zhì)量的最佳比例為0.02∶1。

表5 藥物和脂質(zhì)質(zhì)量比對(duì)粒徑分布和包封率的影響 (n=3,)Tab.5 Influence of various ratios of drug and lipid on the particle size and EE (n=3,)

表5 藥物和脂質(zhì)質(zhì)量比對(duì)粒徑分布和包封率的影響 (n=3,)Tab.5 Influence of various ratios of drug and lipid on the particle size and EE (n=3,)

2.4.6 表面活性劑質(zhì)量濃度篩選 選擇TPGS質(zhì)量濃度分別為10、20、30、40、50 mg·mL-1制備不同批次的CAR-loaded-NLCs,考察其對(duì)粒徑分布和包封率的影響。結(jié)果見表6。由表6可見,使用較低質(zhì)量濃度表面活性劑制備的CAR-loaded-NLCs穩(wěn)定性較差,放置后會(huì)出現(xiàn)脂質(zhì)分層現(xiàn)象,隨著表面活性劑質(zhì)量濃度的增加,CAR-loaded-NLCs的粒徑逐漸降低,包封率逐漸增大,但是當(dāng)TPGS的質(zhì)量濃度增大到50 mg·mL-1時(shí),自身會(huì)形成膠束[12],不利于體系的穩(wěn)定。因此,本研究選擇以質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1的TPGS制備CAR-loaded-NLCs。

表6 不同TPGS 質(zhì)量濃度對(duì)粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.6 Influence of different TPGS concentrations on particle size and EE (n=3,)

表6 不同TPGS 質(zhì)量濃度對(duì)粒徑分布和包封率的影響(n=3,)Tab.6 Influence of different TPGS concentrations on particle size and EE (n=3,)

2.5 CAR-loaded-NLCs質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.5.1 粒徑分布、Zeta電位測(cè)定 按照篩選確定的處方連續(xù)制備3 批CAR-loaded-NLCs,其外觀均為半透明、泛淡藍(lán)色乳光的溶液,未觀察到不溶物、團(tuán)聚體或藥物沉淀;經(jīng)測(cè)定平均粒徑為(91.4±3.6) nm,PDI為(0.167±0.004),表明小而均勻的粒徑分布可提高藥物的溶解度,并促進(jìn)藥物吸收[13];測(cè)得Zeta電位為(-28.7±0.7) mV,表明粒子間具有足夠大的靜電斥力,可確保系統(tǒng)的穩(wěn)定,避免聚集[14]。另外,3批CAR-loaded-NLCs包封率的平均值為(91.8%±1.7%),包封率較高。

2.5.2 微觀形態(tài)觀察 取經(jīng)稀釋的少量CAR-loaded-NLCs均勻鋪展到formvar銅網(wǎng)上,用質(zhì)量濃度為10 mg·mL-1的磷鎢酸負(fù)染色10 min,晾干后用TEM 在200 kV 的加速電壓下觀察CAR-loaded-NLCs的微觀形貌。結(jié)果見圖1。由圖1可見,CAR-loaded-NLCs呈球形,分布均勻,大部分CAR-loaded-NLCs的粒徑在60～120 nm 范圍內(nèi),與激光粒度儀測(cè)定的結(jié)果基本一致。

圖1 CAR-loaded-NLCs的透射電鏡照片F(xiàn)ig.1 Transmission electron micrograph of CAR-loaded-NLCs

2.5.3 體外釋放研究 為了評(píng)估CAR-loaded-NLCs在人體生理環(huán)境中的藥物釋放特性,選擇pH1.2鹽酸溶液、pH4.5醋酸鹽溶液和pH6.8磷酸鹽溶液作為釋放介質(zhì)進(jìn)行研究[15]。取CAR-loaded-NLCs 5 mL(CAR 含量為10 mg)加入處理好的透析袋(截留相對(duì)分子質(zhì)量12 000～14 000)中,系緊兩端,浸入到釋放介質(zhì)中,3種釋放介質(zhì)溶液的體積均為245 mL,溫度為(37±0.5) ℃,磁力攪拌速度為100 r·min-1。在預(yù)定的時(shí)間間隔取5 mL 釋放介質(zhì),經(jīng)過(guò)濾和稀釋,進(jìn)樣檢測(cè)藥物含量。結(jié)果見表7。

表7 CAR-loaded-NLCs在不同介質(zhì)中的體外藥物釋放度(n=3,)Tab.7 In vitro drug release of CAR-loaded-NLCs in different media (n=3,)

表7 CAR-loaded-NLCs在不同介質(zhì)中的體外藥物釋放度(n=3,)Tab.7 In vitro drug release of CAR-loaded-NLCs in different media (n=3,)

結(jié)果顯示,CAR-loaded-NLCs在pH 1.2、pH4.5和pH6.8介質(zhì)溶液中的藥物釋放度均表現(xiàn)為雙相釋放模式,在前2 h 藥物釋放為突釋(游離的和吸附在NLCs表面的藥物釋放);之后表現(xiàn)為緩釋(包裹在NLCs內(nèi)部的藥物釋放)[16]。

2.6 大鼠腸道原位灌注研究

取SD 大鼠,腹腔注射水合氯醛(3 mL·kg-1)麻醉,固定在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上,沿大鼠腹部中線剪開腹腔(長(zhǎng)3～4 cm),分離出小腸和結(jié)腸。在小腸前端和結(jié)腸末端各切一個(gè)小口,插入直徑為0.3 cm 的玻璃管后扎緊,將37 ℃生理鹽水推入腸段清洗腸內(nèi)容物,再注入空氣排凈生理鹽水,將小腸前端和結(jié)腸末端的玻璃管連接到蠕動(dòng)泵硅膠管的兩端,形成回路。移取CARloaded-NLCs加入到含有酚紅的Krebs-Ringer緩沖液(CAR 質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1,酚紅質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1)中,體積為100 mL,作為供試液;另稱取CAR 原料藥加入含有酚紅的Krebs-Ringer緩沖液(CAR 質(zhì)量濃度為250 μg·mL-1,酚紅質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1)中,體積為100 mL,分散形成CAR混懸液,作為對(duì)照溶液。將連接在小腸和結(jié)腸兩端的硅膠管置入供試液中,開啟蠕動(dòng)泵,灌注速度為1 mL·min-1,分別在0、0.5、1、1.5、2、3、4 h時(shí)間點(diǎn)取出5 mL 供試液(同時(shí)補(bǔ)加Krebs-Ringer緩沖液,其含有質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1的酚紅),經(jīng)過(guò)濾、稀釋后檢測(cè)藥物含量(Ci),同時(shí)用紫外分光光度法測(cè)定550 nm 處的酚紅質(zhì)量濃度,根據(jù)酚紅質(zhì)量濃度計(jì)算供試液剩余體積(Vi)。灌注實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剪下腸段,測(cè)量其長(zhǎng)度(L)和內(nèi)徑(r),計(jì)算腸段內(nèi)面積(S=πr2L)。根據(jù)每段時(shí)間間隔內(nèi)CAR 質(zhì)量濃度(Ci)與供試液體積(Vi)計(jì)算出供試液中CAR 剩余量(Qi),以lnQi對(duì)取樣時(shí)間t進(jìn)行線性回歸,其斜率為CAR-loaded-NLCs的吸收速率常數(shù)(Ka),CAR-loaded-NLCs的表觀滲透系數(shù)(Papp)=Ka/S。同法進(jìn)行對(duì)照溶液的灌注實(shí)驗(yàn),計(jì)算CAR 混懸液吸收速率常數(shù)(Ka)和表觀滲透系數(shù)(Papp)。結(jié)果見表8。

表8 CAR-loaded-NLCs和CAR 混懸液的吸收參數(shù) (n=6,)Tab.8 Absorption parameters of CAR-loaded-NLCs and CAR suspensions (n=6,)

表8 CAR-loaded-NLCs和CAR 混懸液的吸收參數(shù) (n=6,)Tab.8 Absorption parameters of CAR-loaded-NLCs and CAR suspensions (n=6,)

注:與CAR 混懸液比較,△P＜0.05。

與CAR 混懸液相比,CAR-loaded-NLCs在大鼠腸道中的Ka和Papp分別由(2.27±0.26)×10-3min-1和(4.16±0.31)×10-4cm·min-1增加到(6.84±0.67)×10-3min-1和(12.97±0.59)×10-4cm·min-1,均提高了近3倍。

3 討論

納米結(jié)構(gòu)脂質(zhì)載體的制備方法[17]包括乳化蒸發(fā)-低溫固化法、熱熔乳化-超聲法、溶劑擴(kuò)散法、高壓均質(zhì)法等,其中高壓均質(zhì)法可減少有機(jī)溶劑的用量,制備的納米粒粒徑分布較均勻,已被公認(rèn)可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)放大[18],因此本研究用高壓均質(zhì)法制備CARloaded-NLCs。

本研究比較了CAR-loaded-NLCs與CAR 混懸液在大鼠腸道的Ka和Papp,結(jié)果顯示,CAR-loaded-NLCs可顯著提高藥物的吸收速率和滲透性。這一方面是由于NLCs的粒徑極小,很容易吸附到腸道上皮細(xì)胞表面并通過(guò)靜態(tài)水層被小腸吸收;另一方面是由于NLCs的脂質(zhì)成分與腸上皮細(xì)胞膜的組成具有一定的相似性,可增加與細(xì)胞膜的親和力,促進(jìn)藥物的吸收或轉(zhuǎn)運(yùn)[19]。