秦皮乙素調(diào)節(jié)Lewis肺癌小鼠的免疫功能及抑瘤作用研究

劉浩明 ,華 毛 ,張 莉 ,朱海宏

1.青海省第五人民醫(yī)院胸外科,西寧 810007;2.青海省人民醫(yī)院外科,西寧 810007

肺癌的臨床治療主要以化療和放療為主,但治療效果尤其是遠期效果仍不理想。秦皮是傳統(tǒng)中草藥,具有抗病原微生物、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、保護神經(jīng)、保護血管及抗腫瘤等多種藥理作用[1-2]。秦皮乙素(esculetin,Esc)又稱七葉亭,是秦皮的主要有效成分,具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、保肝、化痰平喘、調(diào)節(jié)免疫、治療急性肺損傷和糖尿病等作用[3-4]。研究表明,Esc的免疫調(diào)節(jié)作用是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機制之一[5]。本研究擬通過建立Lewis肺癌小鼠模型,觀察Esc對Lewis肺癌的療效,探討其對Lewis肺癌小鼠免疫功能的調(diào)節(jié)作用及對CD4+CD25+Treg細胞分化的影響。

1 儀器與材料

1.1 儀器

多功能酶標(biāo)儀(美國Molecular Device公司);流式細胞儀(美國BD 公司);熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

Esc(質(zhì)量分數(shù)≥98%,批號B20991,上海源葉生物科技有限公司);順鉑(批號P4394-25MG,美國Sigma-Aldrich公司);白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、干擾素γ(interferon-γ,IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(批 號:ab222503、ab252363、ab183218)均購自英國Abcam 公司;LS column、MS column、CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit Ⅱ(批號130-093-227)均購自德國美天旎生物技術(shù)公司;重組轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factorβ1,TGF-β1)(批號1003-RT-050)、白細胞介素-2(IL-2)(批號1020-RL-050)均購自美國R&D 公司;小鼠CD28抗體(批號16-0281-85)、CD3 抗 體(批 號15-0031-63)、CD4抗體-FITC(批號1-0041-81)、CD4抗體-PE抗體(批號12-0041-81)均購自美國eBioscience公司;Prime ScriptTMRT Master MixPerfect Real Time試劑盒(批號RR036A)、SYBR?PremixEx-TaqTM(批號DRR041A)均購自日本TaKaRa公司。

1.3 細胞株

Lewis肺癌細胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.4 動物

SPF級C57BL/6小鼠75 只,雄性,6～8 周齡,體質(zhì)量為18～22 g,購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,合格證號SCXK(京)2016-0011。于SPF級層流柜內(nèi)分籠飼養(yǎng),動物房溫度為20 ℃～25 ℃,相對濕度為45%～55%,光照周期為10～12 h,適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 建立Lewis肺癌小鼠模型

Lewis肺癌細胞接種于含0.1 g·L-1胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(含100 u·mL-1青霉素+100 mg·L-1鏈霉素),置于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期,用滅菌生理鹽水調(diào)整細胞密度為1×107個·mL-1。取60只C57BL/6小鼠,右前肢腋下經(jīng)消毒后接種0.2 mL細胞懸液。接種7 d后,可以觸及皮下結(jié)節(jié)、瘤腫塊長至100～300 mm3時,表明建模成功。本次造模過程中無實驗動物死亡,成功率為100%。

2.2 分組及藥物干預(yù)

將成功造模的60 只小鼠隨機分為模型組、Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組,每組15只;另外15只未接種Lewis肺癌細胞的C57BL/6 小鼠作為正常組。Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組分別給予腹腔注射20、40 mg·kg-1Esc和5 mg·kg-1順鉑,2 d 1次,連續(xù)干預(yù)2周;正常組、模型組實驗期間給予腹腔注射等量無菌生理鹽水。

2.3 小鼠體質(zhì)量變化

藥物干預(yù)后每2 d稱1次小鼠體質(zhì)量,觀察各組小鼠體質(zhì)量的變化情況。

2.4 小鼠瘤質(zhì)量及抑瘤率

末次給藥24 h后,頸椎脫臼處死小鼠,取瘤稱質(zhì)量,計算抑瘤率。抑瘤率=[(模型組平均瘤質(zhì)量-給藥組平均瘤質(zhì)量)÷模型組平均瘤質(zhì)量]×100%。

2.5 小鼠胸腺、脾臟指數(shù)

處死小鼠,取胸腺、脾臟,剝?nèi)ブ静⒂脼V紙吸去表面血跡,用分析天平稱定質(zhì)量,計算小鼠胸腺、脾臟指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量(mg)÷小鼠體質(zhì)量(g)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)÷小鼠體質(zhì)量(g)。

2.6 ELISA 檢測脾臟組織中IL-6、IFN-γ 和TNF-α含量

取部分脾臟組織,用勻漿器將其充分勻漿,以3 000 r·min-1(離心半徑10 cm)離心20 min,收集上清即為血清樣品,設(shè)空白孔、對照品孔和樣品孔,對照品孔加梯度稀釋的對照品,樣品孔先后加入樣品稀釋液與樣品,晃動混勻后封板,37 ℃孵育0.5 h,洗滌5次后拍干,除空白孔外其余各孔加酶標(biāo)試劑50 μL,封板后于37 ℃孵育1 h,洗滌5次后拍干,每孔加顯色液100 μL,晃動混勻,于37 ℃避光顯色20 min,當(dāng)對照品孔出現(xiàn)顏色梯度變化時,加終止液終止反應(yīng),以空白孔調(diào)零,檢測450 nm處的吸光度值A(chǔ),以A值為縱坐標(biāo)(y)、對照品含量為橫坐標(biāo)(x)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算小鼠脾臟組織中IL-6、IFN-γ和TNF-α的含量。

2.7 小鼠脾臟CD4+CD62L+T 細胞的分離、純化及培養(yǎng)

取部分脾臟,用PBS洗滌后,加入淋巴細胞分離液,置于200目篩網(wǎng)研磨,用30 μmol·L-1preseparation Filter過濾,收集細胞懸液,離心30 min,用Buffer洗滌后,用PBS 重懸并計數(shù)。按照Mini MACS CD4+CD62L+T Cell Isolation Kit Ⅱ說明書分離純化CD4+CD62L+T 細胞。用PBS 將細胞密度調(diào)整為1×106個·mL-1,將細胞接種于提前包被好抗CD28抗體(質(zhì)量濃度為3 pg·mL-1)、抗CD3抗體(質(zhì)量濃度為10 pg·mL-1)的96孔板中,同時加入IL-2(質(zhì)量濃度為30 μg·mL-1)、TGF-β(質(zhì)量濃度為5 ng·mL-1)誘導(dǎo)CD4+CD62L+T 細胞向Treg細胞分化,置于37 ℃、體積分數(shù)21% O2、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.8 檢測CD4+CD25+Treg細胞分化數(shù)量

各組小鼠脾臟CD4+CD62L+T 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后,收集細胞,用PBS 清洗后,離心棄上清,用Buffer 100 μL重懸,加入FITC 標(biāo)記的抗CD4熒光抗體(質(zhì)量濃度為1.25 pg·mL-1),PE 標(biāo)記的抗CD25熒光抗體(質(zhì)量濃度為0.6 pg·mL-1),4 ℃避光孵育0.5 h,用PBS清洗2次后重懸,用流式細胞儀進行分析檢測。

2.9 檢測T 淋巴細胞中叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3、IL-10 mRNA 的相對表達量

各組小鼠脾臟CD4+CD62L+T 細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)72 h后,收集細胞,用TRIzol試劑提取細胞總RNA。用Prime ScriptTMRT Master MixPerfect Real Time試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR?PremixExTaqTM 10 μL,上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.4 μL,ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL,模板cDNA 2 μL,DEPC-H2O 6.8 μL。每個樣本設(shè)置3 個平行孔,以β-actin 為內(nèi)參,采用2-△△CT法計算待測基因相對表達量。引物用Primer plus3.0軟件設(shè)計,引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 24.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以()表示,多組間比較用單因素方差分析,進一步兩兩間比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠體質(zhì)量變化

各組小鼠體質(zhì)量在給藥后6 d內(nèi)無明顯差異,6 d后與正常組相比,模型組、Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組小鼠體質(zhì)量均出現(xiàn)不同程度的降低(P＜0.05)。隨著給藥時間的延長,正常組體質(zhì)量增加,模型組、順鉑組體質(zhì)量下降最快,Esc低劑量組體質(zhì)量變化不明顯,Esc高劑量組體質(zhì)量減輕。連續(xù)給藥2周后,各組小鼠體質(zhì)量比較:正常組＞Esc高劑量組＞Esc低劑量組＞模型組＞順鉑組(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表2 小鼠體質(zhì)量比較 (,n=15)Tab.2 Comparison of body weight of mice (,n=15)

表2 小鼠體質(zhì)量比較 (,n=15)Tab.2 Comparison of body weight of mice (,n=15)

注:與正常組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與Esc低劑量組比較,cP＜0.05;與Esc高劑量組比較,dP＜0.05。

3.2 各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率比較

小鼠瘤質(zhì)量、抑瘤率組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與模型組比較,Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組瘤質(zhì)量減輕(P＜0.05);與Esc低劑量組比較,Esc高劑量組、順鉑組瘤質(zhì)量減輕,抑瘤率升高(P＜0.05);與Esc高劑量組比較,順鉑組瘤質(zhì)量減輕,抑瘤率升高(P＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率比較 (,n=15)Tab.3 Comparison of tumor weight and tumor inhibition rate in each group (,n=15)

表3 各組小鼠瘤質(zhì)量和抑瘤率比較 (,n=15)Tab.3 Comparison of tumor weight and tumor inhibition rate in each group (,n=15)

注:與模型組比較,aP＜0.05,與Esc低劑量組比較,bP＜0.05;與Esc高劑量組比較,cP＜0.05?！硎緹o數(shù)據(jù)。

3.3 各組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)比較

小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與正常組比較,模型組、Esc低劑量組和順鉑組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低,Esc高劑量組胸腺指數(shù)升高(P＜0.05);與模型組比較,Esc低劑量組、Esc高劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)升高,順鉑組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低(P＜0.05);與Esc低劑量組比較,Esc高劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)升高,順鉑組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低(P＜0.05);與Esc高劑量組比較,順鉑組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)降低(P＜0.05)。結(jié)果見表4。

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 (,n=15)Tab.4 Comparison of thymus index and spleen index in each group (,n=15)

表4 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 (,n=15)Tab.4 Comparison of thymus index and spleen index in each group (,n=15)

注:與正常組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與Esc低劑量組比較,cP＜0.05;與Esc高劑量組比較,dP＜0.05。

3.4 各組小鼠脾臟組織中IL-6、IFN-γ 和TNF-α 表達水平比較

小鼠脾臟組織中IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達水平組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與正常組比較,模型組、Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組IL-6、IFN-γ和TNF-α表達水平升高(P＜0.05);與模型組比較,Esc 低劑量組、Esc 高劑量組、順鉑組IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達水平降低(P＜0.05);與Esc低劑量組比較,Esc高劑量組、順鉑組IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達水平降低(P＜0.05);與Esc高劑量組比較,順鉑組IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達水平降低(P＜0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組小鼠脾臟組織中IL-6、IFN-γ 和TNF-α 含量比較(,n=15)Tab.5 Comparison of the contents of IL-6,IFN-γ and TNF-α in spleen tissues of each group (,n=15)

表5 各組小鼠脾臟組織中IL-6、IFN-γ 和TNF-α 含量比較(,n=15)Tab.5 Comparison of the contents of IL-6,IFN-γ and TNF-α in spleen tissues of each group (,n=15)

注:與正常組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與Esc低劑量組比較,cP＜0.05;與Esc高劑量組比較,dP＜0.05。

3.5 小鼠體外培養(yǎng)CD4+CD25+Treg細胞分化比例比較

CD4+CD25+Treg細胞分化的比例組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與正常組比較,模型組、Esc低劑量組、Esc 高劑量組和順鉑組CD4+CD25+Treg細胞分化比例升高(P＜0.05);與模型組比較,Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組CD4+CD25+Treg細胞分化比例降低(P＜0.05);與Esc低劑量組比較,Esc高劑量組、順鉑組CD4+CD25+Treg細胞分化比例降低(P＜0.05);與Esc高劑量組比較,順鉑組CD4+CD25+Treg 細胞分化比例降低(P＜0.05)。結(jié)果見表6。

表6 各組小鼠CD4+CD25+Treg細胞分化比例比較 (,n=15)Tab.6 Comparison of the differentiation ratio of CD4+CD25+Treg cells in each group (,n=15)

表6 各組小鼠CD4+CD25+Treg細胞分化比例比較 (,n=15)Tab.6 Comparison of the differentiation ratio of CD4+CD25+Treg cells in each group (,n=15)

注:與正常組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與Esc低劑量組比較,cP＜0.05;與Esc高劑量組比較,dP＜0.05。

3.6 T 淋巴細胞中Foxp3、IL-10 mRNA 的相對表達量比較

T 淋巴細胞中Foxp3、IL-10 mRNA 的相對表達量組間比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。與正常組比較,模型組、Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組Foxp3 mRNA 的相對表達量升高,IL-10 mRNA的相對表達量降低(P＜0.05);與模型組比較,Esc低劑量組、Esc高劑量組和順鉑組Foxp3 mRNA 的相對表達量降低,IL-10 mRNA 的相對表達量升高(P＜0.05);與Esc低劑量組比較,Esc高劑量組、順鉑組Foxp3 mRNA的相對表達量降低,IL-10 mRNA 的相對表達量升高(P＜0.05);與Esc高劑量組比較,順鉑組Foxp3 mRNA 的相對表達量降低,IL-10 mRNA的相對表達量升高(P＜0.05)。結(jié)果見表7。

表7 T 淋巴細胞中Foxp3、IL-10 mRNA 的相對表達量比較(,n=15)Tab.7 Comparison of the relative expression of Foxp3 and IL-10 mRNA in T lymphocytes (,n=15)

表7 T 淋巴細胞中Foxp3、IL-10 mRNA 的相對表達量比較(,n=15)Tab.7 Comparison of the relative expression of Foxp3 and IL-10 mRNA in T lymphocytes (,n=15)

注:與正常組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與Esc低劑量組比較,cP＜0.05;與Esc高劑量組比較,dP＜0.05。

4 討論

Esc又稱6,7-二羥基香豆素,是香豆素的衍生物,可以從蕓香科的檸檬葉、木犀科的苦櫪白蠟樹皮及地黃、顛茄、曼陀羅等天然植物中提取,具有多種藥理活性。近年研究發(fā)現(xiàn),Esc對胃癌、前列腺癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等癌細胞具有抑制增殖、遷移,誘導(dǎo)凋亡的作用[6-9]。LI H 等[10]研究顯示,Esc可以有效抑制肺癌細胞A549的增殖,并通過下調(diào)波形蛋白,上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達來調(diào)節(jié)細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。程峰等[11]研究表明,Esc通過增強小鼠腹腔巨噬細胞趨化、吞噬及NO 釋放功能,從而調(diào)節(jié)其免疫功能。目前,關(guān)于Esc對肺癌患者免疫功能影響的研究鮮有報道,本研究擬通過建立Lewis肺癌小鼠模型,探討Esc對其免疫功能的影響及機制,為Esc藥物的研發(fā)和肺癌的臨床治療提供實驗依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示,經(jīng)Esc干預(yù)后,Lewis肺癌小鼠的體質(zhì)量增加,瘤質(zhì)量減輕,抑瘤率隨著Esc質(zhì)量濃度的上升而升高,胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)升高,脾臟組織中IL-6、IFN-γ和TNF-α的表達水平降低,表明Esc可減輕Lewis肺癌小鼠的炎癥反應(yīng),增強其免疫功能,發(fā)揮抑瘤作用。順鉑是常用的化療藥物,本次實驗的結(jié)果顯示,順鉑組抑瘤效果最好,但胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)顯著降低,提示順鉑具有降低小鼠免疫力的不良反應(yīng)。

CD4+CD25+Treg細胞是調(diào)節(jié)性CD4+T 細胞亞群,在維持機體自身免疫耐受與調(diào)控免疫應(yīng)答水平中發(fā)揮重要作用[12-13]。研究顯示,CD4+CD25+Treg細胞通過抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程[14]。CD4+CD25+Treg細胞表達多種抑制性受體和細胞因子,如TGF-β等,參與抑制腫瘤特異性T 細胞活化,阻滯抗腫瘤免疫反應(yīng),從而促進腫瘤進展,提示CD4+CD25+Treg細胞通過促進腫瘤免疫逃逸加速腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15-17]。MARTINEZ L M 等[18]研究發(fā)現(xiàn),Treg細胞可控制乳腺癌從原位癌向浸潤性乳腺癌的轉(zhuǎn)變。JI L 等[19]研究表明,Treg 細胞浸潤可促進胃癌進展。通過調(diào)節(jié)Treg細胞比例,可改善機體免疫狀態(tài)[20]。本研究取新鮮分離純化的Lewis肺癌小鼠脾臟組織CD4+CD62L+T 細胞,經(jīng)IL-2、TGF-β誘導(dǎo)培養(yǎng)后,用流式細胞術(shù)檢測CD4+CD25+Treg細胞的分化比例,結(jié)果顯示,Esc低劑量組、Esc高劑量組、順鉑組較模型組CD4+CD25+Treg細胞分化比例降低;qRTPCR結(jié)果顯示,Esc低劑量組、Esc高劑量組、順鉑組較模型組CD4+CD25+Treg細胞特異性標(biāo)志分子Foxp3 mRNA 的表達水平降低,抗炎細胞因子IL-10 mRNA 的表達水平升高,提示Esc和順鉑可通過抑制CD4+CD25+Treg細胞分化和Foxp3的表達,上調(diào)IL-10的表達調(diào)節(jié)免疫反應(yīng),改善Lewis肺癌小鼠腫瘤細胞的免疫逃逸。

綜上所述,Esc對Lewis肺癌小鼠具有抑瘤作用,可改善其免疫功能,抑制CD4+CD25+Treg細胞分化,為Esc相關(guān)藥物的研發(fā)及將Esc應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供理論支持。