二氫槲皮素對IgA腎病大鼠腎臟保護(hù)的機制

師旭輝 ,于建軍 ,秦 洋 ,曲礦云* ,劉風(fēng)勛

1.黃河三門峽醫(yī)院腎臟內(nèi)科,三門峽 472000;2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科,鄭州 450000

IgA 腎病(IgA nephropathy,IgAN)是一種慢性進(jìn)展性疾病,多數(shù)患者最終發(fā)展為腎功能衰竭[1]。目前對終末期腎病患者,除腎臟替代治療外,尚無特異性治療手段,因此,探尋延緩IgAN 進(jìn)展、減輕腎臟病理變化的治療方法十分必要[2]。二氫槲皮素(dihydroquercetin,DHQ)存在于花旗松、落葉松等植物中,屬于二氫黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等生物效應(yīng)[3]。磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositide 3-kinase,PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(protein kinase B,Akt)信號通路參與細(xì)胞分化、凋亡、增殖等生命活動[4-5],上調(diào)PI3K/Akt信號通路的表達(dá),可加重腎小管上皮細(xì)胞炎性損傷[6],表明PI3K/Akt信號通路與腎臟疾病的發(fā)展密切相關(guān)。本研究通過建立IgAN 大鼠模型,分析DHQ 對IgAN 大鼠腎臟的保護(hù)作用及其對PI3K/Akt信號通路的作用機制,為臨床治療提供實驗與理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

7600-020型全自動生化分析儀(日立公司);DYCZ-20G 型電泳儀(北京六一生物科技有限公司);1000-液晶型超聲細(xì)胞破碎儀(南京賽飛生物科技有限公司);TGL20M 型臺式超低溫離心機(河南信陵儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為97%)、Masson染色液均購自北京索萊寶科技有限公司;四氯化碳(CCl4)、HE 染色液均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;蓖麻油(北京伊諾凱科技有限公司);脂多糖(大連美侖生物技術(shù)有限公司);二氫槲皮素(DHQ,質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)和740Y-P(質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞96%),均購自上海麥克林生化科技有限公司);TLR4 熒光一抗以及Akt、p-Akt、PI3K 及p-PI3K 抗體均購自美國Abcam 公司

1.3 動物

SPF清潔級SD 雄性大鼠78只,8周齡,體質(zhì)量為(175±25) g,購自北京唯尚立德生物科技有限公司,許可證號為SCXK(京)2016-0009,用普通飼料進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水,喂養(yǎng)1周,實施封閉管理。

2 方法

2.1 建立IgA 腎病大鼠模型

將78 只大鼠分為對照組(15 只)與干預(yù)組(63只),對照組不進(jìn)行任何干預(yù),干預(yù)組灌服BSA溶液(20 g BSA+500 mL 生理鹽水,制成質(zhì)量濃度為40 mg·mL-1的BSA 溶液),隔日1 次,連續(xù)處理6周;每周予以0.1 mL CCl4+0.5 mL蓖麻油皮下注射,連續(xù)處理9周;并于第6周、第8周時,于大鼠尾靜脈注射0.05 mg脂多糖(將10 mg脂多糖充分溶解于1 mL生理鹽水中,再取脂多糖溶液500 μL+生理鹽水100 mL 混勻),直接免疫熒光染色顯示系膜區(qū)有大量IgA 沉積為造模成功[7]。

2.2 動物分組與干預(yù)

干預(yù)組納入造模成功的大鼠58只,隨機分為模型組(14只)、740Y-P組(14只)、DHQ組(15只)、740Y-P+DHQ 組(15 只)。DHQ 組每日用100 mg·kg-1的DHQ溶液(用體積分?jǐn)?shù)0.4%羧甲基纖維素鈉配制)灌胃;740Y-P組腹腔注射740Y-P溶液0.02 mg·kg-1,每日1次;740Y-P+DHQ 組大鼠每日用100 mg·kg-1DHQ溶液灌胃,并腹腔注射740Y-P溶液0.02 mg·kg-1;對照組、模型組用等量生理鹽水灌胃及腹腔注射。上述5組均連續(xù)處理12周。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清炎性因子水平

末次干預(yù)后2 h,將各組大鼠用戊巴比妥鈉腹腔麻醉,采集5 mL 腹主動脈血,以3 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為10 cm),取血清,用ELISA 檢測大鼠血清炎性因子,按照說明書中的步驟稀釋后加樣。設(shè)置空白孔與樣本孔,樣本孔加酶標(biāo)試劑,封板后于37 ℃溫育30 min,加洗滌液,靜置30 s后棄去,重復(fù)5次,拍干,加入顯色劑,37 ℃避光顯色10 min,加入終止液終止反應(yīng),檢測450 nm 處各孔的吸光度,計算大鼠血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)水平。

2.4 全自動生化分析儀測定大鼠腎功能

于末次給藥前24 h收集大鼠尿液,去沉渣,用雙縮脲法測定各組大鼠24 h尿蛋白定量(24 hours urinary protein quantitative,24 h pro);末次干預(yù)后取腹主動脈血標(biāo)本,以3 000 r·min-1離心20 min(離心半徑為10 cm)后,用全自動生化分析儀測定血清肌酐(serum creatinine,Scr)及血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)水平。

2.5 HE染色檢測大鼠腎組織變化

采血完畢,處死大鼠,摘取兩側(cè)腎臟,用體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定(24 h)左腎組織,沖去腎組織表面的結(jié)晶,用體積分?jǐn)?shù)70%、85%、95%、100%、100%乙醇脫水,每梯度30 min,二甲苯透明,浸蠟包埋,切成厚度3 μm 的病理切片;將切片依次放入二甲苯脫蠟15 min(3次),無水乙醇水化,滴加蘇木素染液染色8 min,用自來水沖洗,擦干多余水分,滴加分化液3～4 s,流水沖洗,滴加伊紅染料2 min,乙醇浸潤,切片組織稍干后用中性樹膠封片,置于顯微鏡下觀察腎組織變化。

2.6 Masson染色觀察大鼠腎纖維化

將4 μm石蠟切片放置于60 ℃烤箱,放置3～5 h,脫蠟水化,將Masson 復(fù)合染色液適量滴加在組織上,30 s后用蒸餾水沖洗,加入磷鉬酸鹽(5 min),甩干磷鉬酸鹽,滴加苯胺藍(lán)染色(5 min),用蒸餾水沖洗,滴加分化液2次,45 s后甩干;將組織玻片依次放入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液(1次)、乙醇(2次)浸潤10 s,浸入二甲苯2 min(2次),玻片稍干后封片,置于顯微鏡下觀察染色情況。

2.7 直接免疫熒光染色檢測IgA 沉積

將6 μm 冰凍切片用體積分?jǐn)?shù)4%甲醛固定(10 min),用PBS沖洗,插入玻片架,用檸檬酸鹽緩沖液浸潤,高壓抗原修復(fù)3 min,取出玻片,冷卻至室溫,用PBS沖洗3次,每次5 min,滴加TLR4熒光一抗(FITC標(biāo)記),置于4 ℃冰箱中避光孵育;次日用PBS沖洗3次,每次5 min,稍干后滴加抗熒光淬滅劑(50～100 μL),封片,于-20 ℃保存。

2.8 Western blot測定大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平

取保存于液氮中的右腎,加入蛋白裂解液1 mL,用超聲細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞(3 min),以12 000 r·min-1離心10 min,提取總蛋白,用蛋白質(zhì)定量法檢測各組大鼠右腎蛋白質(zhì)量濃度,用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,用Tween-20磷酸鹽緩沖液封閉(含質(zhì)量濃度為5 g·L-1的脫脂奶粉)1 h,加入Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,次日用TBST洗膜,加入IgG 二抗(1∶5 000)孵育2 h,ECL曝光,置于凝膠成像分析系統(tǒng),以β-actin為內(nèi)參,分析目的蛋白的表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

用Image-Pro plus 6.0軟件采集與分析圖像,用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以()表示,多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DHQ 對IgA 腎病大鼠炎性因子含量的影響

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6 的含量升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P 組大鼠血清IL-1β、TNF-α和IL-6 的含量降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P組比較,DHQ 組血清IL-1β、TNF-α和IL-6的含量降低(P＜0.05)。結(jié)果見表1。

表1 DHQ 對IgA腎病大鼠血清IL-1β、TNF-α 和IL-6水平的影響 ()Tab.1 Effect of dihydroquercetin on serum IL-1β,TNF-α and IL-6 levels in rats with IgA nephropathy ()

表1 DHQ 對IgA腎病大鼠血清IL-1β、TNF-α 和IL-6水平的影響 ()Tab.1 Effect of dihydroquercetin on serum IL-1β,TNF-α and IL-6 levels in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

3.2 DHQ 對IgA 腎病大鼠腎功能的影響

與對照組比較,模型組24 h pro、Scr和BUN 水平升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P 組24 h pro、Scr和BUN 水平升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P組24 h pro、Scr和BUN 水平降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P 組比較,DHQ 組24 h pro、Scr 和BUN 水平降低(P＜0.05)。結(jié)果見表2。

表2 DHQ 對IgA腎病大鼠24 h pro、Scr和BUN 水平的影響 ()Tab.2 Effect of dihydroquercetin on the levels of 24 h pro,Scr and BUN in rats with IgA nephropathy ()

表2 DHQ 對IgA腎病大鼠24 h pro、Scr和BUN 水平的影響 ()Tab.2 Effect of dihydroquercetin on the levels of 24 h pro,Scr and BUN in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

3.3 DHQ對IgA腎病大鼠腎臟HE染色結(jié)果的影響

對照組大鼠腎小球正常,腎間質(zhì)未見炎性浸潤,幾乎無腎小球萎縮;模型組腎小球基底膜增厚,炎性細(xì)胞浸潤,腎小球萎縮;740Y-P組炎性細(xì)胞浸潤及腎小球明顯萎縮,小血管硬化,較模型組大鼠腎臟病理表現(xiàn)加重;DHQ 組病理損傷減輕,腎小球趨于正常,有少量炎性浸潤,較模型組及740Y-P 組改善明顯;DHQ+740Y-P組炎性浸潤、腎小球萎縮有所改善,但程度遠(yuǎn)不及DHQ 組。結(jié)果見圖1。

圖1 大鼠腎組織HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining results of rat kidney tissue

3.4 DHQ 對IgA 腎病大鼠腎纖維化的影響

由表3可知,Masson染色顯示對照組大鼠腎內(nèi)未見明顯藍(lán)色膠原蛋白沉積,腎臟無纖維化;模型組、740Y-P組均沉積較多藍(lán)色膠原蛋白,纖維化程度加重,且740Y-P組更為明顯;DHQ 組藍(lán)色膠原蛋白沉積最少,腎纖維化程度減輕,而DHQ+740Y-P組藍(lán)色膠原蛋白沉積有所減輕,但纖維化程度高于DHQ 組。由圖2可見,與對照組比較,模型組陽性區(qū)占觀察視野面積比升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P組面積比升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P組面積比降低(P＜0.05);與DHQ+740YP組比較,DHQ 組面積比降低(P＜0.05)。結(jié)果見表3、圖2。

表3 DHQ 對IgA腎病大鼠膠原纖維陽性區(qū)占觀察視野面積比和IgA綜合密度的影響 ()Tab.3 Effect of dihydroquercetin on the ratio of collagen fiberpositive area to the observation field and the comprehensive density of IgA in rats with IgA nephropathy ()

表3 DHQ 對IgA腎病大鼠膠原纖維陽性區(qū)占觀察視野面積比和IgA綜合密度的影響 ()Tab.3 Effect of dihydroquercetin on the ratio of collagen fiberpositive area to the observation field and the comprehensive density of IgA in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

圖2 腎組織Masson染色結(jié)果Fig.2 Masson staining results of kidney tissue

3.5 DHQ 對IgA 腎病大鼠直接免疫熒光染色結(jié)果與IgA 沉積的影響

由圖3可知,對照組大鼠腎內(nèi)無綠色熒光;模型組、740Y-P組可見大量IgA 綠色熒光沉積,且740Y-P組更甚;DHQ組僅有微量IgA綠色熒光沉積,而DHQ+740Y-P組IgA綠色熒光沉積程度高于DHQ組。由表3可知,與對照組比較,模型組IgA 密度值升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P組IgA密度值高于模型組,DHQ 組、DHQ+740Y-P組IgA 密度值降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P組比較,DHQ組IgA 密度值降低(P＜0.05)。結(jié)果見表3、圖3。

圖3 腎組織直接免疫熒光染色Fig.3 Direct immunofluorescence staining of kidney tissue

3.6 DHQ 對IgA 腎病大鼠Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K 蛋白表達(dá)水平的影響

與對照組比較,模型組p-Akt、p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平升高(P＜0.05);與模型組比較,740Y-P 組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平升高,DHQ 組、DHQ+740Y-P組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平降低(P＜0.05);與DHQ+740Y-P組比較,DHQ 組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平降低(P＜0.05)。結(jié)果見表4、圖4。

圖4 腎組織Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平Fig.4 Akt,p-Akt,PI3K and p-PI3K protein expression in kidney tissue

表4 DHQ 對IgA腎病大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白表達(dá)的影響 ()Tab.4 Effect of dihydroquercetin on the protein expression of Akt,p-Akt,PI3K,and p-PI3K in rats with IgA nephropathy ()

表4 DHQ 對IgA腎病大鼠Akt、p-Akt、PI3K 和p-PI3K 蛋白表達(dá)的影響 ()Tab.4 Effect of dihydroquercetin on the protein expression of Akt,p-Akt,PI3K,and p-PI3K in rats with IgA nephropathy ()

注:與對照組比較,aP＜0.05;與模型組比較,bP＜0.05;與740Y-P組比較,cP＜0.05;與DHQ 組比較,dP＜0.05。

4 討論

目前研究認(rèn)為[8]IgAN 的發(fā)病與免疫炎癥學(xué)、遺傳學(xué)等機制相關(guān),其發(fā)病伴隨著趨化因子、炎性因子、免疫誘導(dǎo)等的炎癥級聯(lián)反應(yīng),引起機體炎癥浸潤,細(xì)胞因子、活性氧等表達(dá)量增加,引起系膜區(qū)以IgA 為主的復(fù)合物沉積[9-10],病情進(jìn)展下逐漸誘導(dǎo)腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化,導(dǎo)致腎功能發(fā)生不可逆損傷。因此探尋有效藥物來阻斷、延緩IgAN 病情的進(jìn)展,或可阻斷不可逆損傷的發(fā)生,從而改善患者的預(yù)后。

DHQ 又稱花旗松素,結(jié)構(gòu)特殊,生物效用廣泛,抗氧化能力強于普通黃酮類化合物,研究表明,其具有抑制腫瘤、舒張血管、治療高血壓等作用[11-12],且DHQ 還具有抑制細(xì)胞增殖、降低炎癥水平與氧化應(yīng)激的作用[13]。有學(xué)者將DHQ 應(yīng)用于糖尿病腎病大鼠,結(jié)果顯示DHQ 可減輕大鼠模型癥狀,起到保護(hù)腎臟的作用[14]。IgAN是一種炎癥性腎臟疾病,機體多種細(xì)胞因子表達(dá)紊亂,如IL-1β、TNF-α及IL-6等炎性因子持續(xù)作用可激發(fā)內(nèi)皮因子釋放,引起腎小球系膜增生,腎小球內(nèi)皮細(xì)胞通透性增大,進(jìn)而使大分子蛋白濾出腎小球,且炎性因子還可影響氮質(zhì)代謝廢物排泄,導(dǎo)致腎功能發(fā)生進(jìn)展性損傷[15],調(diào)節(jié)炎性因子水平可使腎臟病理損傷減輕[16]。本研究結(jié)果顯示,模型組血清IL-1β、TNF-α和IL-6 水平以及24 h pro、Scr和BUN 的水平高于對照組,提示IgAN 大鼠血清炎性因子過量表達(dá),腎功能受損,而用DHQ處理后上述血清炎性因子與腎功能指標(biāo)明顯下降,說明DHQ 在減輕IgAN 大鼠炎癥反應(yīng)方面效果確切,可調(diào)節(jié)腎小球濾過作用,促進(jìn)Scr、BUN 排出,改善大鼠腎功能。此外,觀察HE、Masson、直接免疫熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn),對照組腎小球正常,腎間質(zhì)未見炎性浸潤,腎臟無纖維化,無IgA 綠色熒光沉積,而造模后大鼠腎小球萎縮,腎臟纖維化程度加強,腎內(nèi)可見大量IgA 綠色熒光沉積,用DHQ 處理后造模大鼠病理情況均有明顯改善,說明DHQ 能減少IgA 沉積,減輕炎癥因子表達(dá),緩解腎臟纖維化,以改善大鼠腎功能。

PI3K/Akt通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),因其能調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、影響細(xì)胞遷移而受到重視,其中PI3K 由調(diào)節(jié)亞基p85與催化亞基p110組成,可接收G 蛋白連接受體傳遞的信號,Akt是PI3K 下游的直接靶蛋白,接收PI3K 觸發(fā)的表達(dá)信息,磷酸化下游諸多功能蛋白等效應(yīng)因子,參與細(xì)胞凋亡、分化、存活等生理過程的調(diào)控,進(jìn)而調(diào)控機體細(xì)胞的活性[17-18]。研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt通路與腎臟缺血再灌注損傷[19]及腎纖維化[20]有關(guān)。為明確DHQ 治療IgAN 大鼠的作用機制,本研究用Western blot檢測PI3K/Akt通路及其相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),模型組p-Akt、p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平高于對照組,表明IgAN 大鼠機體PI3K/Akt通路異常活化,參與IgAN 病情進(jìn)展;在造?；A(chǔ)上使用激動劑740Y-P處理,結(jié)果顯示,740Y-P組p-Akt和p-PI3K蛋白的表達(dá)水平高于模型組,表明腎病理損傷越嚴(yán)重,p-Akt 和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平越高;而用DHQ 處理后,DHQ 組p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平明顯低于740Y-P組、DHQ+740Y-P組,提示即使在740Y-P抵消DHQ 部分作用的情況下,DHQ 仍可下調(diào)p-Akt和p-PI3K 蛋白的表達(dá)水平,由此證實DHQ 可抑制PI3K/Akt信號通路相關(guān)分子的表達(dá),調(diào)節(jié)IgAN 大鼠腎功能,改善預(yù)后。

綜上所述,DHQ 應(yīng)用于IgAN 大鼠,可降低大鼠血清炎性因子表達(dá)水平,明顯減少膠原蛋白與IgA沉積,減輕病理損傷,改善大鼠腎功能,這可能與DHQ 抑制PI3K/Akt通路有關(guān),可為后續(xù)實驗研究及臨床治療提供參考依據(jù)。