粉防己堿通過FEZF1-AS1影響結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥的作用機(jī)制

王晨宇,李興旺,張軍杰,姚坤厚,華 龍,胡軍紅

河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科,開封 475000

結(jié)直腸癌為常見的腹部惡性腫瘤之一,化療是治療結(jié)直腸癌的重要輔助手段,可有效降低結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率[1]。但目前所用的化療藥物普遍存在多藥耐藥性、高不良反應(yīng)等缺陷,腫瘤獲得化學(xué)耐藥性風(fēng)險(xiǎn)較高,是治療癌癥的重大障礙[2]。粉防己堿(tetrandrine,Tet)是一種天然生物堿,在關(guān)節(jié)炎、矽肺等疾病的治療中發(fā)揮重要作用[3]。KUMAR A等[4]研究表明,Tet具有多重耐藥逆轉(zhuǎn)活性。長鏈非編碼RNA(LncRNA)FEZF1-AS1 是人類癌癥形成的關(guān)鍵調(diào)控因子,李宗鑫等[5]研究發(fā)現(xiàn),其在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào),并通過多種潛在機(jī)制調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)為治療結(jié)直腸癌的常用化療藥物。本研究通過建立人結(jié)直腸癌耐LOHP細(xì)胞株,并干擾FEZF1-AS1的表達(dá),分析Tet對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞化療耐藥的作用及機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LSRFortsa X-20 型流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司);CFX Connect型熒光定量PCR 儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 試藥

Tet(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%,上海依赫生物科技有限公司);奧沙利鉑(規(guī)格50 mg,國藥準(zhǔn)字H20093487,浙江海正藥業(yè)股份有限公司);qPCR 試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司);cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Fermentas公司);兔抗人三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞家族C 成員1(adenosine triphosphate binding cassette subfamily C member 1,ABCC1),多藥耐藥基因1(multidrug resistance gene 1,MDR1),P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp),GAPDH 抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗,均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;Annexin V/PI染色試劑盒(江蘇凱基科技生物發(fā)展有限公司)。

1.3 細(xì)胞株

人結(jié)直腸癌敏感細(xì)胞株HCT116購自南京凱基科技生物發(fā)展有限公司。

2 方法

2.1 HCT116/L-OHP細(xì)胞培養(yǎng)

取人結(jié)直腸癌敏感細(xì)胞株HCT116接種于含有50 mL·L-1胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。取處于對(duì)數(shù)生長期的HCT116 細(xì)胞,將細(xì)胞密度調(diào)節(jié)為1×105個(gè)·mL-1,加入L-OHP培養(yǎng)液作用48 h,棄上清,加入無L-OHP 的新鮮培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞恢復(fù)正常生長后,消化傳代,再用L-OHP培養(yǎng)液作用48 h。如此反復(fù)換液、傳代,逐漸提高L-OHP的質(zhì)量濃度(1.6、2.4、3.2、4.0、4.8、9.6、19.52 μg·mL-1),最終獲得對(duì)L-OHP 耐藥的HCT116細(xì)胞,將其命名為HCT116/L-OHP細(xì)胞。

2.2 MTT 法檢測不同質(zhì)量濃度Tet對(duì)L-OHP 細(xì)胞活力的影響

將Tet倍比稀釋到質(zhì)量濃度分別為4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg·mL-1,每孔加入200 μL 相應(yīng)含藥培養(yǎng)基,將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h,取出后進(jìn)行MTT 染色,測定490 nm處的吸光度A值,計(jì)算抑制率。抑制率=[(1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)]×100%。

2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與實(shí)驗(yàn)分組

用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法使HCT116/L-OHP 細(xì)胞轉(zhuǎn)染FEZF1-AS1,設(shè)為FEZF1-AS1 組。將正常培養(yǎng)的HCT116/L-OHP細(xì)胞作為空白組。將無毒劑量的Tet作用于HCT116/L-OHP細(xì)胞48 h作為Tet 組。將Tet 作用于轉(zhuǎn)染了FEZF1-AS1的HCT116/L-OHP細(xì)胞,作為FEZF1-AS1+Tet組。4組細(xì)胞均轉(zhuǎn)染48 h,用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效果,隨后進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 MTT 法檢測各組細(xì)胞的增殖活性

取各組細(xì)胞按2×103個(gè)/孔接種于96孔板,在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)每孔加MTT 溶液20 μL(質(zhì)量濃度5 mg·mL-1),培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加150 μL DMSO,孵育2 h,用酶標(biāo)儀測定490 nm 處的吸光度值A(chǔ)。獨(dú)立重復(fù)測量3次,取均值。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的凋亡率

轉(zhuǎn)染48 h后,用胰酶消化,離心收集各組細(xì)胞,用PBS洗滌,加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,使其密度達(dá)到1×106個(gè)·mL-1。吸取100 μL 細(xì)胞懸液加入流式管,加入Annexin V-FITC 5 μL 和PI 5 μL,混勻后室溫避光孵育15 min。每管加結(jié)合緩沖液400 μL,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

2.6 qRT-PCR 檢測各組細(xì)胞ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達(dá)水平

用Trizol法提取各組細(xì)胞RNA,測定總RNA濃度,按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟合成cDNA,稀釋5倍后進(jìn)行PCR 檢測。反應(yīng)體系:10×Taq緩沖度5 μL,MgC124 μL,dNTPs 1 μL,上、下游引物各1 μL,cDNA 1 μL,TaqDNA 聚合酶0.5 μL,加滅菌雙蒸水至總體積為50 μL。PCR 程序:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,75 ℃延伸45 s,共43個(gè)循環(huán),72 ℃終延伸10 min。上述產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察。各基因引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence

2.7 Western blot檢測各組細(xì)胞中ABCC1、MDR1和P-gp蛋白的表達(dá)水平

用胰酶消化細(xì)胞,冰上裂解細(xì)胞0.5 h,用BCA法檢測各組細(xì)胞蛋白濃度,取20 μL樣本置于沸水浴中5 min變性,配制質(zhì)量濃度為100 g·L-1的SDSPAGE 凝膠,加樣后電泳,將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。將PVDF膜置于質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶中室溫封閉1 h,洗膜后將膜置于含有ABCC1、MDR1、P-gp和GAPDH 抗體(1∶1 000)的平皿內(nèi),于4 ℃搖床中孵育過夜,次日取出洗膜。用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂牛奶稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗(1∶2 000),將PVDF膜置入其中,孵育2 h,洗膜。在PVDF膜上滴加ECL發(fā)光液,用多功能成像儀觀察蛋白的表達(dá)情況。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 26.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),HCT116/LOHP細(xì)胞凋亡率及ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 和蛋白的表達(dá)水平等計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,計(jì)量資料以()表示,多組比較用單因素方差分析,組間兩兩比較用LSD-t分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Tet對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率的影響

隨著Tet倍比稀釋質(zhì)量濃度的下降,細(xì)胞增值抑制率隨之下降。選用抑制率為5%時(shí)Tet的質(zhì)量濃度(0.45 μg·mL-1)作為無毒劑量。結(jié)果見表2。

表2 Tet對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖抑制率的影響Tab.2 Inhibition rate of Tet on the proliferation of HCT116/L-OHP cells

3.2 Tet對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖活性的影響

各組24、48、72 h的HCT116/L-OHP細(xì)胞A490值隨時(shí)間延長而升高,且呈時(shí)間依賴性(P＜0.05)。與空白組比較,FEZF1-AS1組A490值升高,FEZF1-AS1+Tet組、Tet組A490值降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1 組比較,FEZF1-AS1+Tet 組、Tet 組A490值降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組A490值降低(P＜0.05)。結(jié)果見表3。

表3 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖活性比較 (n=3,)Tab.3 Comparison of proliferation activity of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表3 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖活性比較 (n=3,)Tab.3 Comparison of proliferation activity of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05;與24 h比較,&P＜0.05;與48 h比較,▲P＜0.05。

3.3 Tet對(duì)HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡的影響

與空白組比較,FEZF1-AS1組細(xì)胞凋亡率降低,FEZF1-AS1+Tet 組、Tet 組細(xì)胞 凋亡率升高(P＜0.05);與FEZF1-AS1 組比較,FEZF1-AS1+Tet組、Tet 組細(xì)胞 凋亡率升高(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組細(xì)胞凋亡率升高(P＜0.05)。結(jié)果見表4、圖1。

圖1 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡率Fig.1 Apoptosis rate of HCT116/L-OHP cells in each group

表4 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡率比較 (n=3,)Tab.4 Comparison of apoptosis rate of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表4 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞凋亡率比較 (n=3,)Tab.4 Comparison of apoptosis rate of HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05。

3.4 Tet對(duì)細(xì)胞中ABCC1、MDR1和P-gp mRNA表達(dá)水平的影響

與空白組比較,FEZF1-AS1組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達(dá)水平升高,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達(dá)水平降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1 組比較,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA的表達(dá)水平降低(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 的表達(dá)水平下降(P＜0.05)。結(jié)果見表5。

表5 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞中ABCC1、MDR1、P-gp mRNA表達(dá)水平的比較 (n=3,)Tab.5 Comparison of mRNA expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表5 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞中ABCC1、MDR1、P-gp mRNA表達(dá)水平的比較 (n=3,)Tab.5 Comparison of mRNA expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05。

3.5 Tet對(duì)各組細(xì)胞中ABCC1、MDR1 和P-gp表達(dá)水平的影響

與空白組比較,FEZF1-AS1組ABCC1、MDR1、P-gp表達(dá)水平升高,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp表達(dá)水平下降(P＜0.05);與FEZF1-AS1組比較,FEZF1-AS1+Tet組和Tet組ABCC1、MDR1、P-gp表達(dá)水平下降(P＜0.05);與FEZF1-AS1+Tet組比較,Tet組ABCC1、MDR1、Pgp表達(dá)水平下降(P＜0.05)。結(jié)果見表6、圖2。

圖2 Western blot檢測各組HCT116/L-OHP細(xì)胞中ABCC1、MDR1、P-gp蛋白的表達(dá)水平Fig.2 Western blot detection of protein expression levels of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group

表6 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞中ABCC1、MDR1、P-gp表達(dá)水平的比較 (n=3,)Tab.6 Comparison of expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

表6 各組HCT116/L-OHP細(xì)胞中ABCC1、MDR1、P-gp表達(dá)水平的比較 (n=3,)Tab.6 Comparison of expression of ABCC1,MDR1 and P-gp in HCT116/L-OHP cells in each group (n=3,)

注:與空白組比較,*P＜0.05;與Tet組比較,#P＜0.05;與FEZF1-AS1組比較,△P＜0.05。

4 討論

結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)的腫瘤,化療耐藥是目前影響患者長期生存的主要障礙之一[6]?；熌退幨侵改[瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的作用產(chǎn)生耐藥性,從而使化療藥效降低,化療耐藥不能通過增大藥物用量解決[7]?；熌退幨墙Y(jié)直腸癌治療失敗的主要因素,尋找低毒、高效的化療增敏劑十分必要。Tet是提取自傳統(tǒng)中藥粉防己中的雙芐基異喹啉生物堿,為粉防己的主要藥效成分,在癌癥治療中有一定效果[8]。LIN W C等[9]研究發(fā)現(xiàn),Tet對(duì)化療有增敏的作用。腫瘤耐藥細(xì)胞增殖活性抑制、誘導(dǎo)凋亡是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞化療耐藥的主要途徑。HORNG C T 等[10]的研究表明Tet可降低癌細(xì)胞的增殖速度,XU H 等[11]報(bào)道Tet可誘導(dǎo)多種癌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)用無毒劑量的Tet作用于HCT116/L-OHP 細(xì)胞,結(jié)果顯示,與空白組比較,Tet組HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖活性明顯降低、凋亡率明顯升高,提示Tet可抑制HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖活性,并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡,與既往的研究結(jié)果一致。BIAN Z 等[12]通過lncRNA 微陣列確定了FEZF1-AS1是一種在結(jié)直腸癌中高度過量表達(dá)的lncRNA。ZHOU Y 等[13]報(bào)道FEZF1-AS1可通過多種潛在機(jī)制調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖,并發(fā)揮抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。本研究中,與空白組比較,FEZF1-AS1組HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖活性較高、凋亡率較低,提示過表達(dá)FEZF1-AS1可提高HCT116/L-OHP細(xì)胞的增殖活性,并降低凋亡率;與FEZF1-AS1組比較,FEZF1-AS1+Tet組、Tet組HCT116/L-OHP細(xì)胞增殖活性下降、凋亡率升高,提示Tet 可能通過下調(diào)FEZF1-AS1逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的化療耐藥。

Tet可通過多靶點(diǎn)、多途徑提高腫瘤細(xì)胞化療耐藥性,FEZF1-AS1可能是其靶點(diǎn)之一,而化療耐藥機(jī)制復(fù)雜,耐藥基因的參與也是腫瘤化療耐藥發(fā)生的主要因素,Tet 亦可能通過調(diào)控耐藥基因?qū)崿F(xiàn)化療增敏[14]。ABCC1、MDR1基因均為近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤耐藥相關(guān)基因,由其編碼的耐藥蛋白可通過核靶點(diǎn)屏障機(jī)制,參與由細(xì)胞質(zhì)囊泡運(yùn)輸介導(dǎo)的耐藥過程[15]。ABC是負(fù)責(zé)細(xì)胞膜間物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白,參與腫瘤耐藥過程,ABCC1為ABC家族的重要成員,在腫瘤細(xì)胞耐藥中亦扮演重要角色[16]。MDR1是人類腫瘤多藥耐藥基因家族主要成員之一,其表達(dá)與腫瘤耐藥的發(fā)生有關(guān)。MDR1是能量依賴跨膜外排泵,可減少細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積,導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)藥物產(chǎn)生耐受[17]。P-gp作為MDR1的表達(dá)產(chǎn)物,是最常見的耐藥蛋白,功能與MDR1相似,即將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物主動(dòng)泵出,從而降低細(xì)胞內(nèi)化療藥物的有效質(zhì)量濃度,使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性[18-19]。DONG J等[20]研究發(fā)現(xiàn),P-gp過表達(dá)會(huì)促進(jìn)某些抗癌藥物從腫瘤細(xì)胞內(nèi)流出,從而導(dǎo)致多藥耐藥,故認(rèn)為抑制P-gp可能是克服癌癥多藥耐藥的策略之一。本研究的結(jié)果顯示,與FEZF1-AS1組比較,FEZF1-AS1+Tet組、Tet 組細(xì)胞內(nèi)ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 與蛋白的表達(dá)水平逐漸降低,提示Tet 可能通過下調(diào)FEZF1-AS1,并下調(diào)ABCC1、MDR1、P-gp的表達(dá)水平發(fā)揮逆轉(zhuǎn)細(xì)胞化療耐藥的作用。

綜上所述,Tet可逆轉(zhuǎn)HCT116/L-OHP細(xì)胞對(duì)L-OHP的耐藥,機(jī)制可能與下調(diào)FEZF1-AS1 并抑制ABCC1、MDR1、P-gp mRNA 和蛋白的表達(dá)有關(guān)。