基于超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜的深靜脈血栓模型大鼠血漿代謝組學(xué)分析

谷 艷, 臧 鵬, 李進(jìn)霞, 閆燕艷, 王 佳

(1. 山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 山西 大同 037009; 2. 大同市第三人民醫(yī)院, 山西 大同 037000)

深靜脈血栓(DVT)是血栓栓塞性疾病的一種,是指血液在深靜脈內(nèi)不正常凝結(jié)引起的靜脈回流障礙性疾病,多發(fā)生于下肢,深靜脈血栓具有高發(fā)病率、高死亡率和高后遺癥3大特點(diǎn)[1]。深靜脈血栓患者在急性階段若不能得到及時(shí)診斷和有效治療,一些血栓可能會(huì)脫落,造成肺等重要臟器栓塞而死亡;而大約1/3的深靜脈血栓患者會(huì)發(fā)生血栓后綜合征,伴有腫脹、疼痛、皮膚改變和/或靜脈潰瘍,造成長期病痛,影響生活和工作。因此,有效預(yù)防深靜脈血栓已經(jīng)成為一個(gè)非常重要的公共衛(wèi)生問題。然而,深靜脈血栓是一種多因素疾病,涉及復(fù)雜的遺傳、代謝和環(huán)境相互作用[2],因此有必要深入了解深靜脈血栓的病理生理特征,從而為該病的有效預(yù)防、早期診斷和藥物作用靶點(diǎn)提供支撐。

代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,它以生物體內(nèi)的小分子代謝產(chǎn)物為分析對(duì)象,研究疾病、外源性物質(zhì)、生活方式、環(huán)境因素等對(duì)機(jī)體代謝組所產(chǎn)生的整體效應(yīng)和系統(tǒng)作用,從而能夠了解疾病的潛在分子機(jī)制,尋找具有診斷價(jià)值的生物標(biāo)記物和/或治療靶點(diǎn)[3]。代謝譜分析已成為研究復(fù)雜代謝疾病和實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的一種新方法。目前,采用代謝組學(xué)方法研究動(dòng)物深靜脈血栓代謝特征的報(bào)道較少。Sung等[4]建立了DVT小鼠模型并采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和核磁共振氫譜(1H-NMR)技術(shù),研究了DVT小鼠血清及血管壁的代謝特征,結(jié)果發(fā)現(xiàn)DVT的代謝紊亂主要表現(xiàn)為能量代謝、鞘脂和腺苷代謝。曹潔等[5]利用1H-NMR平臺(tái)研究了DVT大鼠的尿液代謝物譜,發(fā)現(xiàn)差異代謝物主要與多個(gè)能量代謝途徑有關(guān),并可能成為DVT形成的候選生物標(biāo)志物。代謝組學(xué)在血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用提高了我們對(duì)DVT代謝改變的認(rèn)識(shí),并可以指導(dǎo)未來確定人類可能的DVT生物標(biāo)志物。盡管在識(shí)別DVT差異代謝物及其在血栓形成中的改變方面取得了技術(shù)進(jìn)步,但我們?nèi)匀徊涣私釪VT代謝改變發(fā)生的機(jī)制和途徑,因此仍需要進(jìn)行大量的研究。

本研究采用基于超高效液相色譜-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Orbitrap HRMS)的代謝組學(xué)技術(shù)測定了DVT大鼠的血漿代謝譜,采用多元及單元統(tǒng)計(jì)分析方法篩選與DVT相關(guān)的差異代謝物,分析代謝通路的變化,研究DVT形成的代謝機(jī)制,從而為進(jìn)一步深入理解DVT的病理機(jī)制、尋找診斷標(biāo)志物及藥物作用靶點(diǎn)提供有價(jià)值的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LEGATO130微量注射泵(美國KD Scientific公司); WD-2102B酶標(biāo)儀(北京六一生物科技有限公司); CX41顯微鏡(日本Olympus公司); 2235切片機(jī)(德國Leica公司); Heraeus Fresco17離心機(jī)、Vanquish超高效液相色譜、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜(美國Thermo Fisher公司)。

甲醇和乙腈均為色譜純,購自德國CNW公司,色譜純氨水購自美國Thermo Fisher公司,乙酸銨和內(nèi)標(biāo)(三甲胺-d9-N-氧化物、氯化膽堿-三甲基-d9、L-亮氨酸-5,5,5-d3、馬尿酸-d5、鄰氨基苯甲酸-環(huán)-13C6)均為色譜純,購自美國Sigma公司。分別精密稱取適量內(nèi)標(biāo)于100 mL容量瓶中,用甲醇-乙腈(1∶1, v/v)溶解至刻度,得到5種內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,分別精密量取適量各內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于同一100 mL容量瓶中,用甲醇-乙腈(1∶1, v/v)稀釋至刻度,得到含有內(nèi)標(biāo)的提取液,其中各內(nèi)標(biāo)濃度如下:2 μmol/L(三甲胺-d9-N-氧化物)、0.06 μmol/L(氯化膽堿-三甲基-d9)、8 μmol/L(L-亮氨酸-5,5,5-d3)、0.6 μmol/L(馬尿酸-d5)、0.04 μmol/L(鄰氨基苯甲酸-環(huán)-13C6)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

20只SPF級(jí)SD大鼠,雄性,180～220 g,購自蘇州西山生物技術(shù)有限公司,許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為假手術(shù)組和DVT模型組,每組10只大鼠。

1.3 動(dòng)物模型建立及樣本采集

模型組參照文獻(xiàn)[6]構(gòu)建不完全結(jié)扎的大鼠股靜脈血栓模型,即以10%水合氯醛腹腔注射麻醉(300 mg/kg),麻醉生效后,剃去大鼠腹股溝處鼠毛并消毒皮膚,沿左腹股溝區(qū)中點(diǎn)行2 cm縱向切口,分離左股靜脈,在左股靜脈近心端處繞以絲線不完全結(jié)扎,使血管腔縮小約1/2,以減慢血流,從左股靜脈遠(yuǎn)心端緩慢注入10%高滲鹽水0.4 mL,此時(shí)可觀察到股靜脈變?yōu)榘导t色,提示血栓形成,檢查周圍組織無出血后縫合切口,外敷消毒紗布[6]。假手術(shù)組不結(jié)扎、不給予高滲鹽水刺激,其余操作同模型組。造模后第7 d,各組大鼠用5%水合氯醛腹腔麻醉,腹主動(dòng)脈取血,一部分血液置于冷水浴冷卻的肝素抗凝管中,用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測血中D-二聚體水平;另一部分血液同樣置于冷水浴冷卻的肝素抗凝管中,混勻,以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速于4 ℃離心10 min,分離血漿并保存于-80 ℃冰箱中用于代謝譜分析。同時(shí)經(jīng)原切口取出各組大鼠股靜脈血栓段,進(jìn)行常規(guī)固定、包埋、切片,行蘇木精-伊紅染色法后置于光鏡下觀察兩組大鼠局部血栓形成靜脈段組織形態(tài)學(xué)的差異。

1.4 樣本制備

取血漿100 μL,加入400 μL含內(nèi)標(biāo)的提取液甲醇-乙腈(1∶1, v/v),渦旋混勻30 s,冰水浴超聲10 min, -40 ℃靜置1 h以沉淀蛋白質(zhì),以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速于4 ℃離心15 min,取上清液進(jìn)樣分析。同時(shí)所有樣品取等量上清液混合制備質(zhì)量控制(QC)樣品。

1.5 分析條件

色譜柱:Waters UPLC BEH Amide色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相:A相為水,含25 mmol/L乙酸銨和25 mmol/L氨水,B相為乙腈;柱溫:35 ℃;流速:0.5 mL/min;自動(dòng)進(jìn)樣器溫度:4 ℃;進(jìn)樣量:2 μL。梯度洗脫程序:0～0.5 min, 95%B; 0.5～7.0 min, 95%B～65%B; 7.0～8.0 min, 65%B～40%B; 8.0～9.0 min, 40%B; 9.0～9.1 min, 40%B～95%B; 9.1～12.0 min, 95%B。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正負(fù)離子切換模式;鞘層氣體流速:30 Arb;輔助氣體流速:25 Arb;毛細(xì)管溫度:350 ℃;采集方法:信息依賴型采集(IDA)模式;采集時(shí)間:12 min;掃描范圍:m/z70～1 050;全MS分辨率:60 000, MS/MS分辨率:7 500;歸一化碰撞能量:10%、30%、60%;噴射電壓:3 600 V(ESI+)/-3 200 V(ESI-)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后,使用XCMS程序進(jìn)行峰提取、峰對(duì)齊、積分等處理[7],得到原始離子峰表。刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰,同時(shí)用每個(gè)離子峰最小值的1/2填補(bǔ)缺失值,并采用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正,最后與BiotreeDB(V2.1)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配進(jìn)行代謝物注釋。多元統(tǒng)計(jì)分析包括主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA),由SIMCA-P軟件(16.0.2版本,Umetrics AB公司,瑞典)完成。OPLS-DA模型的可靠性和預(yù)測性采用7次循環(huán)交互驗(yàn)證法評(píng)價(jià),參數(shù)R2Y、Q2(R2Y表示模型對(duì)Y變量的解釋率,Q2表示模型預(yù)測能力)用以評(píng)估模型質(zhì)量;響應(yīng)排序檢驗(yàn)(n=200)用來考察OPLS-DA模型的準(zhǔn)確性,即將原始分類的Y矩陣、200次不同排列的Y矩陣與R2Y、Q2進(jìn)行線性回歸,得到的回歸直線與y軸的截距值分別為R2和Q2,用以判斷模型是否過擬合。變量重要性(VIP)值用來評(píng)價(jià)OPLS-DA模型中每個(gè)變量的貢獻(xiàn)。Studentt檢驗(yàn)用來檢驗(yàn)代謝物在兩組間差異的顯著性,P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。人類代謝組數(shù)據(jù)庫(HMDB)用來確定差異代謝物的類別,差異代謝物的代謝通路分析主要基于京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(KEGG)。

2 結(jié)果與討論

2.1 兩組大鼠行為學(xué)比較

造模前兩組大鼠均精神狀況良好,四肢活動(dòng)及飲食正常。造模后假手術(shù)組大鼠精神狀態(tài)仍良好,左下肢無明顯腫脹,行動(dòng)無明顯受限。模型組大鼠造模后精神狀況一般,左下肢明顯腫脹,顏色青紫,活動(dòng)減少。

2.2 兩組大鼠血液中D-二聚體水平比較

D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白的特異性降解產(chǎn)物之一,是繼發(fā)性纖溶的特有代謝產(chǎn)物。D-二聚體的水平與血栓的大小和活動(dòng)性相關(guān),DVT形成的同時(shí)纖溶系統(tǒng)也被激活,血液中D-二聚體濃度上升[8],因而D-二聚體是臨床中DVT的常用輔助診斷指標(biāo)。通過ELISA檢測血中D-二聚體水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組及DVT模型組中D-二聚體的平均質(zhì)量濃度分別為(41.67±4.57) μg/L和(108.77±9.44) μg/L,模型組的數(shù)值顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.1×10-28)。

2.3 兩組大鼠靜脈血栓段的組織形態(tài)學(xué)差異

如圖1所示,假手術(shù)組中整個(gè)血管內(nèi)膜表面平整,內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊,少量內(nèi)皮細(xì)胞脫落,管腔中無血栓形成(見圖1a);模型組中靜脈管腔被血栓堵塞,血管內(nèi)皮剝落,血管壁炎性細(xì)胞浸潤較為嚴(yán)重(見圖1b)。綜上所述,顯示大鼠深靜脈血栓模型構(gòu)建成功。

圖 1 (a)假手術(shù)組與(b)DVT模型組大鼠靜脈血栓的蘇木精-伊紅染色Fig. 1 Hematoxylin-eosin staining of venous thrombosis in (a) sham surgery control and (b) deep vein thrombosis (DVT) rat groups

圖 2 ESI模式下血漿樣本的PCA得分圖Fig. 2 Principal component analysis (PCA) score plots of the plasma samples in ESI mode

2.4 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

為了了解分析平臺(tái)的穩(wěn)定性,首先將QC樣品、假手術(shù)組和DVT模型組提取得到的離子峰進(jìn)行PCA分析,如圖2所示,正、負(fù)離子模式下QC樣本緊密聚集在一起。其次計(jì)算QC樣品中內(nèi)標(biāo)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差,結(jié)果發(fā)現(xiàn)正離子模式下3個(gè)內(nèi)標(biāo)三甲胺-d9-N-氧化物、氯化膽堿-三甲基-d9和L-亮氨酸-5,5,5-d3峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.35%、3.13%和5.64%,負(fù)離子模式下內(nèi)標(biāo)L-亮氨酸-5,5,5-d3、馬尿酸-d5和鄰氨基苯甲酸-環(huán)-13C6峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為10.8%、4.23%和5.16%,所有內(nèi)標(biāo)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。以上結(jié)果說明數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,分析平臺(tái)具有良好的穩(wěn)定性。

2.5 DVT大鼠血漿代謝物譜的改變

采用UHPLC-Orbitrap HRMS平臺(tái)在正、負(fù)離子模式下分別采集假手術(shù)組和DVT模型組的血漿代謝物譜信息,數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理后正、負(fù)離子模式可分別得到4 292和3 501個(gè)變量。計(jì)算模型組中所有變量相對(duì)于假手術(shù)組的變化倍數(shù)(FC),并采用火山圖直觀觀察DVT模型組中所有變量的變化情況,火山圖中偏離軸線的點(diǎn)表示在模型組中發(fā)生了明顯改變的變量(P<0.05)(見圖3)。同時(shí)采用多元統(tǒng)計(jì)分析,通過建立可靠的數(shù)學(xué)模型來進(jìn)一步研究DVT大鼠的代謝譜特點(diǎn)。首先進(jìn)行PCA分析,由圖4a可見,DVT模型組與假手術(shù)組有分離的趨勢。為了進(jìn)一步放大組間差異,將假手術(shù)組和模型組的血漿代謝譜數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析,這種方法可以過濾掉代謝物中與分類變量不相關(guān)的正交變量,并對(duì)非正交變量和正交變量分別分析,從而獲得更加可靠的代謝物組間差異[9]。由圖4b可見,兩組樣本區(qū)分非常顯著,說明DVT大鼠血漿代謝物譜較假手術(shù)組發(fā)生了明顯改變。經(jīng)7次循環(huán)交互驗(yàn)證得到的模型評(píng)價(jià)參數(shù)(R2Y、Q2)分別為0.995、0.738(正離子模式)和0.978、0.721(負(fù)離子模式),R2Y、Q2均大于0.5,說明建立的OPLS-DA模型穩(wěn)定可靠。響應(yīng)置換檢驗(yàn)的R2、Q2截距分別為0.23、-0.17(正離子模式)和0.27、-0.19(負(fù)離子模式),表明模型有效,不存在過擬合現(xiàn)象。

圖 3 假手術(shù)組與DVT模型組大鼠血漿代謝物火山圖Fig. 3 Volcano maps of the rat plasma metabolites in the sham surgery control and DVT model groups FC: fold change of metabolite in DVT model group versus the control group; P-value: calculated in student t-test which was used to test the significance of metabolites between the two groups. Red dot: the level of metabolite was upregulated in DVT model group. Blue dot: the level of metabolite was downregulated in DVT model group. Gray dot: the level of metabolite was not changed in DVT model group.

圖 4 假手術(shù)組與DVT模型組大鼠血漿代謝物的(a)PCA和(b)OPLS-DA得分圖Fig. 4 (a) PCA and (b) orthogonal to partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score plots of rat plasma metabolites in the sham surgery control and DVT model groups

2.6 差異代謝物篩選及鑒別

篩選在兩個(gè)OPLS-DA模型中VIP>1,且FC≤0.5或FC≥2,同時(shí)P<0.05的變量,經(jīng)與BiotreeDB(V2.1)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫匹配后,最終在正、負(fù)離子模式下共篩選得到27種差異代謝物,見表1。這些代謝物在假手術(shù)組與DVT模型組間存在著顯著性差異,反映了DVT大鼠的代謝紊亂情況。圖5可視化地展示了差異代謝物在假手術(shù)組和DVT模型組間的變化情況。具體表現(xiàn)為,與假手術(shù)組相比,DVT模型組中三甲基胺氮氧化物(TMAO)、維生素K、鵝去氧膽酸、?；撬帷?-甲基煙酰胺、7-酮膽固醇、反式十六烷基-2-烯醇肉堿、乙烯基乙酰甘氨酸、丙酰脯氨酸、咪唑乙酸、咪唑乙酸核糖苷、1,3,7-三甲基尿酸、1-丁胺、2-羥基異丙酸、吡哆醛、5α-四氫皮質(zhì)酮、苯乳酸的水平顯著升高;而3-脫氫肉堿、磷脂酰膽堿22∶6/20∶2(PC 22∶6/20∶2)、甘油二酯18∶3/20∶4(DG 18∶3/20∶4)、溶血磷脂酰膽堿20∶2(LysoPC 20∶2)、波維酸、鵝肌肽、L-肌肽、辛酸、羥基丙酮酸、3-羥基癸酸的水平顯著降低。

表 1 假手術(shù)組與DVT模型組間的血漿差異代謝物

圖 5 假手術(shù)組與DVT模型組大鼠血漿差異代謝物熱圖Fig. 5 Heat map of the differential metabolites in the sham surgery control and DVT model groups

2.7 代謝通路分析

為了尋找差異代謝物體現(xiàn)的代謝通路的改變,采用了基于KEGG代謝通路的差異豐度(DA)分析,結(jié)果見圖6。由圖可知,DVT模型大鼠與假手術(shù)組的代謝通路差異主要集中在組氨酸代謝、膽汁分泌、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝、初級(jí)膽汁酸生物合成和β-丙氨酸代謝,且每一代謝通路中至少包含2個(gè)差異代謝物。其中,膽汁酸分泌通路(涉及上調(diào)的1-甲基煙酰胺、鵝去氧膽酸和?；撬?和初級(jí)膽汁酸生物合成通路(涉及上調(diào)的鵝去氧膽酸和?；撬?在DVT模型組中均上調(diào);甘油磷脂代謝通路(涉及下調(diào)的磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿)、亞油酸代謝通路(涉及下調(diào)的磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、波維酸)、β-丙氨酸代謝通路(涉及下調(diào)的鵝肌肽和L-肌肽)在DVT模型組中均下調(diào);組氨酸代謝通路中既包含上調(diào)的差異代謝物咪唑乙酸核糖苷、咪唑乙酸,也包含下調(diào)的鵝肌肽和L-肌肽,因而其差異豐度得分為0。

圖 6 基于京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫的通路差異豐度得分圖Fig. 6 Differential abundance score plot by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathways Different color indicated the different metabolic classifications of the pathway. The positive value of the line segment indicated the pathway was upregulated in DVT model group. The negative value of the line segment indicated that the pathway was downregulated in DVT model group. The size of the segment endpoint indicated the number of differential metabolites involved in the pathway.

在本研究中,采用代謝組學(xué)方法觀察到DVT模型大鼠的血漿代謝表型與假手術(shù)組相比存在明顯差異,多種代謝產(chǎn)物在DVT模型組中發(fā)生了顯著改變(FC≤0.5或FC≥2),代謝通路差異主要集中在初級(jí)膽汁酸生物合成、膽汁分泌、組氨酸代謝、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝和β-丙氨酸代謝。

膽汁酸及脂代謝:與假手術(shù)組比較,鵝去氧膽酸、?；撬?、1-甲基煙酰胺水平在DVT模型組中均顯著升高。鵝去氧膽酸和?；撬崾悄懝檀荚诟闻K轉(zhuǎn)化生成的初級(jí)膽汁酸,1-甲基煙酰胺是膽汁酸分泌途徑中的代謝物,它們的水平升高可能提示DVT大鼠初級(jí)膽汁酸生物合成以及膽汁酸分泌途徑被激活。研究證實(shí)膽汁酸是激活多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的信號(hào)分子[10],血漿膽汁酸水平增多,能夠激活法尼類X受體(FXR)[11], FXR在調(diào)節(jié)肝內(nèi)膽汁酸合成和分泌以及脂質(zhì)和葡萄糖代謝中起著關(guān)鍵作用[12],而鵝去氧膽酸、膽酸及其結(jié)合物?；撬崾荈XR的有效內(nèi)源性配體[13],動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)它們通過激活FXR可顯著降低空腹血糖、血漿膽固醇、甘油三酯、脂肪酸等所有脂質(zhì)標(biāo)記物[14]。在DVT模型組中,我們發(fā)現(xiàn)除了變化倍數(shù)較大的PC(22∶6/20∶2)、DG(18∶3/20∶4)、LysoPC(20∶2)、辛酸、脂肪酸β-氧化的中間產(chǎn)物3-羥基癸酸、亞油酸的共軛代謝物波維酸濃度顯著下降外,葡萄糖和其他多種脂類代謝物濃度也在模型組中顯著下降(P<0.05,但FC沒有達(dá)到差異代謝物篩選條件),如膽固醇、PC(18∶1/16∶0)、PC(22∶6/20∶1)、PC(22∶5/18∶2)、PC(22∶4/15∶0)、PC(18∶2/15∶0)、LysoPC(20∶4)、DG(18∶3/20∶3)、LysoPC(20∶2)和花生四烯酸。因而,本實(shí)驗(yàn)中葡萄糖及脂類代謝產(chǎn)物濃度在DVT模型組中顯著下調(diào)也同樣證實(shí)了升高的初級(jí)膽汁酸對(duì)糖脂代謝的調(diào)節(jié)作用。

組氨酸代謝途徑中有4條代謝去路,最終分別代謝為鵝肌肽、L-天冬氨酸、L-谷氨酸和硫脲酸。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組氨酸向鵝肌肽代謝去路中的代謝產(chǎn)物L(fēng)-肌肽和鵝肌肽水平在模型組中均下調(diào),說明這條代謝途徑不是DVT大鼠體內(nèi)組氨酸代謝的主要途徑。然而,我們發(fā)現(xiàn)組氨酸向L-天冬氨酸代謝去路中的2個(gè)中間產(chǎn)物咪唑乙酸核糖苷、咪唑乙酸在模型組中均上調(diào),說明DVT大鼠體內(nèi)組氨酸代謝可能主要通過向L-天冬氨酸轉(zhuǎn)變的途徑完成。

β-丙氨酸代謝途徑中涉及的差異代謝物鵝肌肽和L-肌肽在模型組中顯著下調(diào)。L-肌肽和鵝肌肽均是二肽,它們都可以分解成β-丙氨酸,模型組中我們發(fā)現(xiàn)β-丙氨酸濃度顯著增多(P=4.0×10-3, FC=1.7),說明DVT大鼠體內(nèi)鵝肌肽和L-肌肽的分解代謝加強(qiáng),從而生成更多的β-丙氨酸。有文獻(xiàn)報(bào)道,鵝肌肽和L-肌肽在抗氧化和抗炎反應(yīng)中具有重要的生理作用[15,16],而DVT模型組中這兩種物質(zhì)的下調(diào),可能使它們不能發(fā)揮對(duì)靜脈血栓形成后炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用,當(dāng)然這種推測還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。

其他差異代謝物:TMAO是三甲胺的氧化產(chǎn)物,是動(dòng)物和人類常見的代謝物。TMAO主要在腸道菌群的作用下,由食物中的磷脂酰膽堿或肉堿轉(zhuǎn)化而成。研究報(bào)道血液中TMAO濃度升高會(huì)增強(qiáng)血小板的反應(yīng)性、促進(jìn)血栓的形成[17,18],本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組中TMAO水平較假手術(shù)組顯著上調(diào),也進(jìn)一步印證了TMAO與血栓形成的關(guān)聯(lián)性。維生素K濃度在模型組中明顯升高。維生素K是γ-羧化酶的輔酶,主要參與肝合成凝血因子,具有促進(jìn)凝血的作用,模型組中維生素K水平增加說明模型組大鼠體內(nèi)處于高凝狀態(tài),易于血栓的形成。羥基丙酮酸,存在于從細(xì)菌到人類的所有生物體中。羥基丙酮酸主要在絲氨酸轉(zhuǎn)移酶催化下由L-絲氨酸轉(zhuǎn)變而來,隨后一方面通過生成甘油酸或2-羥基-3-氧丙酸酯進(jìn)入抗壞血酸和醛酸代謝途徑,另一方面通過生成羥基乙醛進(jìn)入維生素B6代謝途徑,并與2-氧代丁酸、丙氨酸反應(yīng)后最終轉(zhuǎn)變成吡哆醇和吡哆醛。我們發(fā)現(xiàn)DVT模型組中羥基丙酮酸濃度明顯下降,而吡哆醛濃度明顯升高,說明DVT大鼠體內(nèi)羥基丙酮酸主要向生成維生素B6的途徑轉(zhuǎn)化。與假手術(shù)組相比,DVT大鼠的肉堿代謝也發(fā)生了明顯改變,表現(xiàn)為3-脫氫肉堿顯著減少,反式十六烷基-2-烯?；鈮A顯著增多。3-脫氫肉堿是L-肉堿在腸道細(xì)菌作用下分解生成的中間產(chǎn)物[19], 3-脫氫肉堿進(jìn)一步分解為三甲胺,后者隨即轉(zhuǎn)化為TMAO[20]。由于本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TMAO在DVT模型組中顯著升高,因此我們推測DVT大鼠的腸道菌群較為活躍,提高了L-肉堿的腸道代謝能力。反式十六烷基-2-烯?；鈮A是一種特殊的?；鈮A,其在體內(nèi)的積累能夠促進(jìn)機(jī)體促炎癥因子的表達(dá),并誘導(dǎo)c-Jun氨基末端激酶(JNK)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)的磷酸化[21]。靜脈血栓形成后血管壁通常會(huì)伴有炎癥細(xì)胞的浸潤,本實(shí)驗(yàn)中反式十六烷基-2-烯?；鈮A在DVT大鼠血漿中顯著增多可能是靜脈血栓形成后發(fā)生血管壁炎癥反應(yīng)的原因之一。此外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)在DVT大鼠血漿中7-酮膽固醇水平顯著升高。7-酮膽固醇是一種氧化甾醇,是膽固醇的主要氧化產(chǎn)物,正常情況下在血液循環(huán)中的含量較低,但在一些心血管疾病中7-酮膽固醇會(huì)在血漿和組織中積累并與疾病的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[22]。研究發(fā)現(xiàn),7-酮膽固醇能誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞促炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和環(huán)氧合酶-2(COX2)的mRNA表達(dá)以及提高COX2酶的活性,從而引起內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[22]; 7-酮膽固醇損傷內(nèi)皮細(xì)胞并增加凝血蛋白的表達(dá)和釋放[23]; 7-酮膽固醇誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的生成,激活內(nèi)皮細(xì)胞中與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡有關(guān)的信號(hào)通路[24]。這些研究表明7-酮膽固醇對(duì)機(jī)體的毒性作用主要與其損害血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能有關(guān),內(nèi)皮細(xì)胞功能受損會(huì)引起動(dòng)脈粥樣硬化、血栓形成等心血管疾病[24]。本實(shí)驗(yàn)DVT模型組中7-酮膽固醇濃度較假手術(shù)組明顯增高,提示7-酮膽固醇可能通過損傷DVT大鼠的血管內(nèi)皮細(xì)胞、誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)等作用促進(jìn)血栓的形成。

3 結(jié)論

本研究采用基于UHPLC-Orbitrap HRMS技術(shù)的代謝組學(xué)方法研究了DVT大鼠的血漿代謝特征。結(jié)果表明,DVT大鼠的血漿代謝譜與假手術(shù)組相比發(fā)生了顯著變化,主要體現(xiàn)在初級(jí)膽汁酸生物合成、膽汁分泌、組氨酸代謝、亞油酸代謝、甘油磷脂代謝和β-丙氨酸代謝方面發(fā)生了不同程度的紊亂。此外,實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)DVT模型組中一些與血栓形成和炎癥相關(guān)的代謝物如TMAO、維生素K、反式十六烷基-2-烯?；鈮A、7-酮膽固醇、鵝肌肽和L-肌肽的水平同樣發(fā)生了顯著改變。本文的研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入探討深靜脈血栓的病理代謝過程、尋找診斷標(biāo)志物以及藥物作用靶點(diǎn)提供參考,也表明代謝組學(xué)方法是研究疾病機(jī)理的一種重要手段。