食管鱗狀細(xì)胞癌患者組織中l(wèi)ncRNA-TUG1 的 表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

郭 劍 袁麗俠

食管癌（EC）是消化系統(tǒng)中常見的惡性腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率居惡性腫瘤的第9 位，病死率居第6 位，在亞洲地區(qū)及非洲東南部的發(fā)病率較高[1]。EC 主要分為食管腺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌（ESCC），其中ESCC 是EC 的主要組織學(xué)亞型。在中國，平均每年有15 萬左右的EC 患者死亡，其中90%以上為ESCC 患者[2]。ESCC 的發(fā)病較為隱匿且早期癥狀不明顯，大多數(shù)患者在確診時已是中晚期，其5 年生存率僅15%左右。因此，亟需尋找一種能夠早期診斷ESCC 的生物標(biāo)志物。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度大于200 nt 的非編碼RNA，具有廣泛的生物學(xué)功能，可通過與DNA、蛋白質(zhì)等大分子相互作用，調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。?；撬嵘险{(diào)基因1（TUG1）位于人類染色體22q12.2，可通過與甲基化的PRC2蛋白結(jié)合，調(diào)控與生長相關(guān)的基因表達(dá)[3]。Young等[4]的研究表明，沉默lncRNA-TUG1 可使發(fā)育中的視網(wǎng)膜細(xì)胞生長減慢，或致其凋亡。研究表明，lncRNA-TUG1 在結(jié)腸癌、胃癌等消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[5-6]，但目前其與ESCC 相關(guān)的報道較少。本研究檢測了ESCC 組織中l(wèi)ncRNA-TUG1 的表達(dá)水平，并分析其與ESCC患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013 年10 月至2015 年10 月在渭南市中心醫(yī)院行ESCC 根治性切除術(shù)的103 例患者的腫瘤組織及癌旁組織（距腫瘤組織邊緣＞5 cm）標(biāo)本。所有組織在采集后均于30 min 內(nèi)進(jìn)行速凍處理，并保存于－80 ℃的冰箱中待用。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前未接受放射、化學(xué)治療；（2）術(shù)后經(jīng)病理檢查確診為ESCC；（3）簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）并發(fā)其他惡性腫瘤者；（2）心、肝、腎等重要器官功能不全者；（3）合并自身免疫性疾病者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

103 例ESCC 患者中男性70 例（67.96%），女性33 例（32.04%），年齡41～72 歲，平均年齡為（59.81±7.62）歲。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）和美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）于2017 年聯(lián)合發(fā)布的第八版食管癌TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期[7]，其中Ⅰ期25 例，Ⅱ期22 例，Ⅲ期30 例，Ⅳ期26 例；術(shù)后經(jīng)病理檢查確診的分化程度為低分化20 例，中分化32 例，高分化51 例。

1.2 lncRNA-TUG1 水平檢測

采用實時定量PCR（real time qRT-PCR）法測定lncRNA-TUG1 的表達(dá)水平。使用TRIzol 試劑盒提取ESCC 組織及癌旁組織標(biāo)本中的總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。使用酶標(biāo)儀測定RNA 的濃度和純度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA。使用PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，之后95 ℃ 20 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法表示lncRNA-TUG1的相對表達(dá)量。PCR 引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.3 隨訪

采用門診或電話的方式對ESCC 患者進(jìn)行為期5 年的隨訪。隨訪開始時間為術(shù)后，第1 年每3個月隨訪1 次，第2 年每6 個月隨訪1 次，之后每年隨訪1 次。隨訪截至2020 年10 月，以患者死亡作為隨訪終點(diǎn)事件。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，采用Cox 比例風(fēng)險回歸模型對ESCC 患者的預(yù)后影響因素進(jìn)行單因素和多因素分析。P＜0.5 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA-TUG1 在ESCC 組織及癌旁組織中的表達(dá)水平

lncRNA-TUG1 在ESCC 組織中的相對表達(dá)量為3.28±0.26，高于癌旁組織（1.03±0.09），兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.2 lncRNA-TUG1 的表達(dá)水平與ESCC 患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)103 例ESCC 患者lncRNA-TUG1 的相對表 達(dá)量的中位數(shù)（1.58），將患者分為lncRNA-TUG1高表達(dá)組（≥1.58，n＝58）和lncRNA-TUG1 低表達(dá)組（＜1.58，n＝45）。結(jié)果顯示，lncRNA-TUG1的表達(dá)水平與患者的年齡、性別、煙酒史及腫瘤位置（靠近咽部者為高位，靠近胃下端者為低位，處于中間者為中位）無關(guān)（P＞0.05）；與患者的腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，lncRNATUG1 高表達(dá)組中Ⅲ～Ⅳ期者、低分化者、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的占比顯著高于lncRNA-TUG1 低表達(dá)組，兩組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P 均＜0.05）。見表2。

表2 lncRNA-TUG1表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.3 lncRNA-TUG1 的表達(dá)水平與ESCC 患者預(yù)后的關(guān)系

生存分析結(jié)果顯示，lncRNA-TUG1 高表達(dá)組的5 年生存率為24.14%，低于lncRNA-TUG1 低表達(dá)組（51.11%），兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖1。

圖1 不同lncRNA-TUG1 表達(dá)水平的ESCC 患者的生存分析

2.4 影響ESCC 患者預(yù)后生存的相關(guān)因素

將患者的年齡、性別、煙酒史、腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤位置和lncRNA-TUG1水平作為自變量，將ESCC 患者的預(yù)后生存情況作為因變量，納入Cox 單因素回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和lncRNA-TUG1水平均與ESCC 患者的預(yù)后生存有關(guān)（P 均＜0.05）。將單因素分析中P＜0.05 的項目，包括腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和lncRNA-TUG1 水平作為自變量，將ESCC 患者的預(yù)后生存情況作為因變量，納入Cox 多因素回歸分析，結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和lncRNA-TUG1 高表達(dá)是ESCC 患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險因素（P 均＜0.05）。見表3。

3 討論

EC 是一種具有異質(zhì)性且容易高度惡化的消化道腫瘤，在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅人類的健康。在中國，每年有數(shù)十萬人死于EC，且主要以ESCC 亞型為主。近年來，雖然ESCC 的治療方式得到了顯著改進(jìn)，但患者的5年生存率并未明顯升高。大多數(shù)EC 患者早期癥狀不明顯，確診時常已失去手術(shù)機(jī)會。因此，尋找一種新的潛在標(biāo)志物，加強(qiáng)對ESCC 的早期診斷、預(yù)防和治療是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。

表3 影響ESCC 患者預(yù)后生存的單因素和多因素Cox 比例風(fēng)險回歸分析

lncRNA 在機(jī)體正常的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的作用，可調(diào)控基因表達(dá)，參與染色體重排、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄激活與干擾等過程。此外，lncRNA 也參與了包括腫瘤在內(nèi)的人體多種疾病的調(diào)控。研究表明，lncRNA 與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。lncRNA-TUG1 最初是在小鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)的[4]。Zhang 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNATUG1 在骨肉瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的分期、大小及患者預(yù)后密切相關(guān)，lncRNA-TUG1 高表達(dá)的患者術(shù)后生存時間顯著低于低表達(dá)者。Cai 等[10]的研究表明，lncRNA-TUG1 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者中呈高表達(dá)，當(dāng)其被沉默后，神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對化學(xué)治療的敏感度增高。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-TUG1 在體外可通過介導(dǎo)miR-148a-3p/MCL-1/Wnt/β-catenin軸調(diào)控ESCC 的生物學(xué)功能和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[11]。另有研究表明，lncRNA-TUG1 可能通過與PRC2 結(jié)合，從而在ESCC 的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用[12-13]。本研究結(jié)果指出，lncRNA-TUG1 在ESCC 組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，這提示lncRNA-TUG1 的表達(dá)可能與ESCC 的發(fā)病有關(guān)。此外，本研究還指出，lncRNA-TUG1 的表達(dá)水平與患者的腫瘤分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，lncRNA-TUG1的表達(dá)水平越高，患者的腫瘤分期越高，腫瘤分化程度越低，且更容易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這提示lncRNA-TUG1 可能與ESCC 的轉(zhuǎn)移及惡化相關(guān)。

多項研究表明，lncRNA-TUG1 可作為膀胱癌、結(jié)腸癌、宮頸癌的預(yù)后指標(biāo)[14-16]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA-TUG1 高表達(dá)的ESCC 患者術(shù)后生存率顯著低于lncRNA-TUG1 低表達(dá)者，這提示lncRNATUG1 的表達(dá)水平可能可以預(yù)測ESCC 患者的預(yù)后生存情況。Cox 回歸分析結(jié)果表明，lncRNA-TUG1高表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響ESCC 患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險因素。該結(jié)果提示在臨床中需要加強(qiáng)對lncRNA-TUG1 高表達(dá)患者的術(shù)后監(jiān)測，必要時予以輔助治療，以防止疾病復(fù)發(fā)。

綜上所述，ESCC 患者的腫瘤組織中l(wèi)ncRNATUG1 的表達(dá)水平較高，且其表達(dá)水平與ESCC 的發(fā)生、發(fā)展及患者的預(yù)后生存情況密切相關(guān)；監(jiān)測ESCC 患者lncRNA-TUG1 的表達(dá)水平有助于判斷病情進(jìn)展及預(yù)后情況。今后需對lncRNA-TUG1在ESCC 中的具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探究。