克羅恩病患者組織中激活轉(zhuǎn)錄因子4 的表達(dá)水平 及意義

項(xiàng)芳芳 李楊亮 陳曉桃 姚寒暉

克羅恩病（CD）是一種慢性腸道炎性疾病，其在歐美國(guó)家的發(fā)病率較高，以往在中國(guó)的發(fā)病率較低，近年來(lái)隨著飲食習(xí)慣的改變，在中國(guó)CD的發(fā)病率呈升高趨勢(shì)[1]。CD 具有復(fù)發(fā)率高、并發(fā)癥多的特點(diǎn)，臨床表現(xiàn)主要包括腹痛、腹瀉、便血等，病情嚴(yán)重者可發(fā)生腸梗阻或穿孔[2-3]。CD 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被證實(shí)與CD 的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4-6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞死亡，損傷黏膜屏障功能，促進(jìn)腸道的炎性反應(yīng)，從而引發(fā)炎癥性腸病[7]。激活轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）是一種堿性亮氨酸拉鏈蛋白，參與了機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)及腫瘤生長(zhǎng)等多種病理、生理過(guò)程。多項(xiàng)研究表明，ATF4 可通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與疾病的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，如多發(fā)性骨髓瘤[8]、前列腺癌[9]、肝損傷[10]及帕金森病[11]等。由此推測(cè)，ATF4 可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與CD 的發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。本研究檢測(cè)了CD 患者組織中ATF4 的表達(dá)水平，并探討其與患者的炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻性選取2015 年2 月至2017 年2 月淮南新華醫(yī)療集團(tuán)新華醫(yī)院收治的75 例CD 患者作為研究對(duì)象，設(shè)為CD 組。參照《中國(guó)炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的共識(shí)意見(jiàn)》[12]中關(guān)于CD 的診斷及治療標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診治。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）患者體征、癥狀及影像學(xué)檢查結(jié)果符合CD 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）首次診斷為CD；（3）入組前未服用激素類、免疫抑制劑類藥物；（4）簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并惡性腫瘤；（2）合并全身感染性疾?。唬?）嚴(yán)重心、肝、腎功能不全者；（4）隨訪失聯(lián)者。另選取同期在該院行腸息肉切除術(shù)的80 例患者作為對(duì)照組。CD 組中男性46 例，女性29 例，年齡21～43歲，平均年齡為（28.34±4.93）歲，平均體質(zhì)量指數(shù)（BMI）為（21.78±2.79）kg/m2。對(duì) 照組中男性43 例，女性37 例，年齡23～45 歲，平均年齡為（29.61±4.73）歲，平 均BMI 為（22.12±2.93）kg/m2。 兩 組 患 者 在 性 別（χ2＝0.911，P＝0.340）、年 齡 （t＝1.637，P＝0.104）、BMI（t＝0.739，P＝0.461）方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 臨床資料收集和隨訪

收集患者的年齡、性別、BMI、吸煙史、病變部位、肛周病變、疾病行為、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、紅細(xì)胞沉降率（ESR）及治療方案等信息。

CD 患者確診后，采用電話或復(fù)診的方式對(duì)患者進(jìn)行為期3 年的隨訪，期間每3 個(gè)月隨訪1 次，了解患者的預(yù)后情況。末次隨訪時(shí)間為2020 年3月10 日，以腹腔膿腫、腸梗阻、腸穿孔、消化道大出血、腸瘺、接受腸切除手術(shù)或因CD 死亡作為隨訪終點(diǎn)事件。本研究將在隨訪期間發(fā)生終點(diǎn)事件定義為預(yù)后不良，反之，則定義為預(yù)后良好。

1.3 CD 炎性反應(yīng)狀態(tài)評(píng)價(jià)

采用簡(jiǎn)化克羅恩病活動(dòng)指數(shù)（CDAI）評(píng)分評(píng)估患者的病情嚴(yán)重程度，評(píng)分項(xiàng)目包括腹痛、腹部包塊、腹瀉和伴隨疾病[13]。腹痛：輕度疼痛記1分，中度疼痛記2 分，重度疼痛記3 分；腹部包塊：可疑包塊記1 分，確診包塊記2 分，伴觸痛記3 分；腹瀉每日1 次記1 分；伴隨疾病包括關(guān)節(jié)痛、虹膜炎、結(jié)節(jié)性紅斑、壞疽性膿皮病、阿弗他潰瘍、肛裂、新瘺管和膿腫，每種癥狀記1 分。簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分為4 項(xiàng)評(píng)分之和，其中5～7 分為輕度活動(dòng)，8～16分為中度活動(dòng)，＞16 分為重度活動(dòng)。

采用克羅恩病簡(jiǎn)化內(nèi)鏡評(píng)分（SES-CD）評(píng)估末端回腸、右半結(jié)腸、橫結(jié)腸、左半結(jié)腸及直腸的病情嚴(yán)重程度，評(píng)分項(xiàng)目包括潰瘍大小、潰瘍面積、受累腸道面積和腸腔狹窄，評(píng)分范圍由輕至重依次為0～3 分。SES-CD 評(píng)分為各腸段4 項(xiàng)評(píng)分之和，其中4～10 分為輕度活動(dòng)，11～19 分為中度活動(dòng)，≥20 分為重度活動(dòng)[14]。

1.4 ATF4 表達(dá)水平檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)ATF4 的表達(dá)水平。具體步驟：取結(jié)直腸鏡檢查時(shí)切除的CD 組織和腸息肉組織，無(wú)菌條件下分別在液氮中研磨組織，然后以3 500 r/min 離心15 min，取上層清液，加入蛋白酶抑制劑提取總蛋白；采用10% SDS-PAGE 分離膠電泳，轉(zhuǎn)模后室溫封閉1 h；加入一抗（1 ∶ 1 000），4 ℃孵育過(guò)夜；用PBST 清洗3 次，加入二抗（1 ∶5 000），室溫下孵育1 h。洗膜后加入ECL顯影劑，應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。CD 組ATF4 的表達(dá)水平與簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分及SES-CD 評(píng)分的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)法分析。采用ROC 曲線評(píng)估ATF4 判斷CD 患者預(yù)后的價(jià)值。采用多因素logistic 回歸法分析影響CD 患者預(yù)后的因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD 組和對(duì)照組的ATF4 表達(dá)水平比較

CD 組患者組織中ATF4 的相對(duì)表達(dá)量為0.74±0.18，低于對(duì)照組（1.25±0.20），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝16.649，P＜0.001）。

2.2 ATF4 與簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分及SES-CD 評(píng)分的關(guān)系

CD 組患者的簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分、SES-CD 評(píng)分分別為（9.17±3.13）分和（12.73±3.84）分。CD 組患者組織中ATF4 的表達(dá)水平與簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分及SES-CD 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)（r＝－0.615，P＜0.001； r＝－0.551，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 ATF4 與兩種評(píng)分的相關(guān)性散點(diǎn)圖 A 簡(jiǎn)化CDAI評(píng)分 B SES-CD 評(píng)分

2.3 ATF4 判斷CD 患者預(yù)后的價(jià)值

隨訪結(jié)果顯示，75 例CD 患者中32 例（42.67%）預(yù)后不良，其中3 例（4.00%）腹腔膿腫，2 例（2.67%）腸梗阻，1 例（1.33%）消化道大出血，3 例（4.00%）腸瘺，23 例（30.67%）接受腸切除手術(shù)治療。根據(jù)CD 患者的預(yù)后情況將其分為預(yù)后不良組（n＝32）和預(yù)后良好組（n＝43）。預(yù)后不良組ATF4 的相對(duì)表達(dá)量為0.60±0.09，低于預(yù)后良好組（0.84±0.16），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝8.288，P＜0.001）。ATF4 判斷CD 患者預(yù)后的ROC 曲線下面積（AUC）、敏感度、特異度、最佳截?cái)嘀捣謩e為0.902（95%CI：0.812～0.959）、87.50%、86.05%和0.69。見(jiàn)圖2。

圖2 ATF4 判斷CD 患者預(yù)后的ROC 曲線

2.4 預(yù)后良好組與預(yù)后不良組的基本資料比較

兩組在性別、年齡、BMI、吸煙史、病變部位、CRP、ESR、1 年內(nèi)應(yīng)用免疫抑制劑方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05）。預(yù)后不良組中肛周病變者、首次治療應(yīng)用激素者、疾病行為為穿透型者的占比均高于預(yù)后良好組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.5 影響CD 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素分析

將單因素分析結(jié)果中可能與CD 患者預(yù)后有關(guān)的項(xiàng)目，包括肛周病變（無(wú)＝0，有＝1）、首次治療應(yīng)用激素（否＝0，是＝1）、疾病行為（非狹窄非穿透型/狹窄型＝0，穿透型＝1）、ATF4（≤0.69＝0，＞0.69＝1）作為自變量，將CD 患者的預(yù)后情況（預(yù)后良好＝0，預(yù)后不良＝1）作為因變量，納入多因素logistic 回歸分析，結(jié)果顯示肛周病變（OR＝ 2.617，95%CI：1.163～7.263，P＝0.013）、 疾 病 行為（ 穿 透 型，OR＝4.828，95%CI：1.842～14.082，P＜0.001）和首次治療應(yīng)用激素（OR＝1.638，95% CI：1.105～3.721，P＝0.036）均 是CD 預(yù) 后 的 獨(dú)立 危 險(xiǎn) 因 素（P 均＜0.05），ATF4（OR＝0.548，95%CI：0.397～0.733，P＝0.023）是CD 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素（P＜0.05）。

表1 影響CD 患者預(yù)后的單因素分析

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與CD 的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切[15]。正常狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)主要發(fā)揮蛋白質(zhì)加工、合成及轉(zhuǎn)運(yùn)等功能，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧、氧化應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等環(huán)境時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中聚集，鈣離子的儲(chǔ)存及釋放平衡被打破，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生[16]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生后可引起腸上皮細(xì)胞中潘氏細(xì)胞減少或功能受損，造成由潘氏細(xì)胞分泌的防御素、溶菌酶及分泌型免疫球蛋白A 等的水平降低，導(dǎo)致腸道屏障功能減弱，同時(shí)使抗原物質(zhì)易被機(jī)體攝取，誘發(fā)腸道炎性反應(yīng)，加重CD 病情[17-19]。ATF4 是參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵物質(zhì)，可能通過(guò)上述機(jī)制參與CD 的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程[20]。本研究結(jié)果顯示，CD 組患者組織中ATF4 的表達(dá)水平低于對(duì)照組，這提示ATF4 可能與CD 的發(fā)病有關(guān)。

簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分是基于CD 患者的臨床癥狀、體征及并發(fā)癥等進(jìn)行評(píng)估，SES-CD 評(píng)分是通過(guò)內(nèi)鏡檢查潰瘍直徑、潰瘍面積、炎性病變侵犯腸段面積、腸管狹窄情況等進(jìn)行評(píng)估，可以直觀地評(píng)估患者的炎性反應(yīng)狀態(tài)，兩種評(píng)分均可在一定程度上反映CD 患者的炎性反應(yīng)程度。本研究結(jié)果顯示，CD 患者組織中ATF4 的表達(dá)水平與簡(jiǎn)化CDAI 評(píng)分和SESCD 評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果提示ATF4 與CD 患者的炎性反應(yīng)狀態(tài)密切相關(guān)，可能參與了CD 的病情進(jìn)展，檢測(cè)其水平或可評(píng)估CD 患者的預(yù)后情況。

郝曉煒等[21]的報(bào)道指出，CD 患者的預(yù)后不良發(fā)生率為42.19%。本研究結(jié)果顯示75 例CD 患者的預(yù)后不良發(fā)生率為42.67%，與上述結(jié)果相近。此外，本研究結(jié)果顯示預(yù)后不良組ATF4 的表達(dá)水平低于預(yù)后良好組，這提示ATF4 可能與CD 患者的預(yù)后有關(guān)。ROC 曲線結(jié)果顯示，ATF4 診斷CD 患者預(yù)后的AUC、敏感度和特異度分別為0.902、87.50%和86.05%，這提示ATF4 判斷CD 預(yù)后的價(jià)值較高。

趙甲秀[22]的研究表明，肛周病變、疾病行為是CD 預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。楊榮萍等[23]的研究亦證實(shí)肛周病變、疾病行為是CD 預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，此外，該研究還表明初始治療應(yīng)用糖皮質(zhì)激素也是CD 預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。本研究結(jié)果顯示，肛周病變、疾病行為（穿透型）和首次治療應(yīng)用激素是CD 預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相符。本研究結(jié)果還表明，ATF4 是CD 預(yù)后的獨(dú)立保護(hù)因素，其原因可能是CD 組織中ATF4的水平可反映內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度，進(jìn)而反映CD 預(yù)后，關(guān)于其病理、生理機(jī)制仍有待今后進(jìn)一步證實(shí)。

本研究存在一定不足，如為單中心研究、樣本量偏小等，納入樣本難免存在選擇偏倚，下一步將開(kāi)展多中心、大樣本研究以驗(yàn)證本文結(jié)論。綜上所述，ATF4 在CD 組織中低表達(dá)，且與CD 患者的炎性反應(yīng)狀態(tài)及預(yù)后有關(guān)。ATF4 在CD 患者組織中的表達(dá)水平越低，提示患者發(fā)生預(yù)后不良的風(fēng)險(xiǎn)越高，檢測(cè)ATF4 的表達(dá)水平有助于判斷患者的病情及預(yù)后。