lncRNA SNHG3 對(duì)Hedgehog 信號(hào)通路和結(jié)直腸癌 細(xì)胞增殖的影響

劉展翅 王一卓

結(jié)直腸癌（CRC）是全球范圍內(nèi)第3 位常見(jiàn)惡性腫瘤，是第4 位腫瘤相關(guān)死亡原因，每年約有120 萬(wàn)例新發(fā)病例及60 萬(wàn)例死亡病例[1]。由于CRC 的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率較高，故患者的預(yù)后較差[2-3]。因此，尋找能早期診斷CRC 的有效生物標(biāo)志物非常重要。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）在惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[4]，一些lncRNA 已被報(bào)道通過(guò)多種機(jī)制參與腫瘤的病理過(guò)程[5]。小核仁RNA 宿主基因3（SNHG3）是位于1 號(hào)染色體的非編碼RNA，為SNHG 家族成員，其能促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷 移[6]。Hedgehog 信號(hào)通路由配體和受體等組成。配體為HH 蛋白，包括Sonic Hedgehog（SHH）、Indian Hedgehog（IHH）和Desert Hedgehog（DHH）3 種。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的受體包括跨膜蛋白受體Ptch、G蛋白偶聯(lián)受體Smo。Hedgehog 信號(hào)通路還包括轉(zhuǎn)錄因子膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因（Gli）[7]。Hedgehog 信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、組織分化和器官形成等生理過(guò)程中起著重要作用，胚胎期Hedgehog 通路異常會(huì)導(dǎo)致多種嚴(yán)重的缺陷，成年期Hedgehog 通路異常激活可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[8]。本研究探討了CRC 組織中的lncRNA SNHG3 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，以及敲低CRC 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3表達(dá)對(duì)Hedgehog 通路和CRC 細(xì)胞增殖的影響，以期揭示lncRNA SNHG3 在CRC 中的作用及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 患者的一般資料和組織樣本

選擇2017 年2 月至2019 年10 月在空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)并經(jīng)病理確診為CRC的61 例患者，其中男性42 例，女性19 例，年齡范圍21～78 歲，平均年齡為（57±7.23）歲，采集手術(shù)切除標(biāo)本的CRC 組織及癌旁組織（距離腫瘤邊緣≥3 cm）。所有患者術(shù)前均未接受任何治療，切除的組織標(biāo)本立即用液氮冷凍，并在-80 ℃冰箱保存。所有患者均簽署了知情同意書(shū)，本研究獲得了醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人CRC 細(xì)胞系LoVo、SW480 和正常人結(jié)腸組織細(xì)胞系CCD-18Co 均購(gòu)自美國(guó)菌種保藏中心（ATCC）。所有細(xì)胞使用RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco 公司），添加10%胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）、100 μg/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素（美國(guó)Gibco公司），在37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

本研究使用由蘇州GenePharma 公司設(shè)計(jì)并合成的2 個(gè)以lncRNA SNHG3 為靶點(diǎn)的shRNA 序列 （sh-SNHG3-1 和sh-SNHG3-2）及陰性對(duì)照序列（shCtrl），均搭載pGPU6 載體。sh-SNHG3-1 序列為：5'-GGGCACTTCGTAAGGTTTAAA-3'；sh-SNHG3-2序列為：5'-GGTTGAGTGCAAGATGAGTTA-3'。為了 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，所有細(xì)胞系均使用300 μg/mL 新霉素篩選至少2 周。所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染均采用LipofectamineTM3000 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司），均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 定量RT-PCR 檢測(cè)

采用TRIzol 試劑 （美國(guó)Invitrogen 公司）從組織和細(xì)胞中提取總RNA?；パa(bǔ)脫氧核糖核酸（cDNA）用PrimeScriptTMRT Reagent Kit 試 劑（日本TaKaRa 公司）合成。定量RT-PCR（qRT-PCR）檢測(cè)采用StepOnePlus real-time PCR 系統(tǒng)（美國(guó)Applied Biosystems 公司）和SYBR?Premix Ex TaqTM試劑（日本TaKaRa 公司）。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、74 ℃ 30 s，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞增殖情況檢測(cè)

細(xì)胞增殖情況使用CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測(cè)，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種在96 孔板上，37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱分別培養(yǎng)1～5 d。每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵化1 h。利用酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）分析各孔細(xì)胞在450 nm 處的光密度值（OD）。所有樣本至少重復(fù)3次試驗(yàn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件，統(tǒng)計(jì)作圖應(yīng)用GraphPad Prism 8.0 軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示。兩組或多組之間的差異采用雙尾Student t 檢驗(yàn)或單因素方差分析（ANOVA），然后采用Post-Hoc檢驗(yàn)。lncRNA SNHG3 表達(dá)水平與Gli1 mRNA 表達(dá)水平之間的關(guān)系采用Pearson 卡方檢驗(yàn)。CRC 患者的總生存期采用Kaplan-Meier 法和log-rank 檢驗(yàn)評(píng)價(jià)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織及細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平比較

本研究檢測(cè)并比較了61 例患者的CRC 組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示前者較后者顯著升高（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。本研究檢測(cè)并比較了人CRC 細(xì)胞系LoVo、SW480和正常人結(jié)腸組織細(xì)胞系CCD-18Co 中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示兩種CRC 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平均較正常結(jié)腸組織細(xì)胞顯著升高（P 均＜0.01），見(jiàn)圖1B。

注：與癌旁組織或CCD-18Co細(xì)胞相比，**P＜0.01

2.2 CRC 組織中l(wèi)ncRNA SNHG3 表達(dá)水平與患者臨床病理特征及總生存率的相關(guān)性分析

61 例患者CRC 組織中l(wèi)ncRNA SNHG3 表達(dá)水平的中位數(shù)為1.83，根據(jù)中位數(shù)將患者分為高表達(dá)組（≥1.83，30 例）和低表達(dá)組（＜1.83，31 例），比較2 組的臨床病理特征。結(jié)果如表2 所示，2 組的年齡、性別和腫瘤直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；2 組的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。該結(jié)果提示CRC組織中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平與CRC 患者的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，本研究采用Kaplan-Meier 法繪制了2 組患者的生存曲線圖，結(jié)果顯示低表達(dá)組患者的5 年總生存率較高表達(dá)組患者高，見(jiàn)圖2。

表2 CRC 組織中l(wèi)ncRNA SNHG3 表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

圖2 高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存曲線圖

2.3 不同組織中Gli1 mRNA 的表達(dá)水平比較及其與lncRNA SNHG3 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

本研究檢測(cè)并比較了不同組織中Gli1 mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，CRC 組織中的Gli1 mRNA的表達(dá)水平較癌旁組織顯著升高（P＜0.01），見(jiàn) 圖3A。Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果顯示，患者CRC 組織中的lncRNA SNHG3 表達(dá)水平與Gli1 mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.574 2，P＜0.01），見(jiàn)圖3B。

圖3 不同組織中Gli1 mRNA 的表達(dá)水平比較及其與lncRNA SNHG3 表達(dá)水平的關(guān)系 A CRC 組織與癌旁組織中Gli1 mRNA 的表達(dá)水平比較 B CRC 組織中Gli1 mRNA 與lncRNA SNHG3 表達(dá)水平的相關(guān)性分析

2.4 敲低lncRNA SNHG3 表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞增殖的影響

本研究設(shè)計(jì)并合成了2 個(gè)shRNA（sh-SNHG3-1和sh-SNHG3-2）來(lái)敲低人CRC 細(xì)胞系SW480 和LoVo 中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)，結(jié)果如圖4 所示，sh-SNHG3-1 和sh-SNHG3-2 均可有效敲低lncRNA SNHG3 的 表 達(dá)（P 均＜0.01）， 由 于sh-SNHG3-1的效果更好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用sh-SNHG3-1。利用sh-SNHG3-1 轉(zhuǎn)染敲低SW480 細(xì)胞和LoVo 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)，其后檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖情況，結(jié)果如圖5 所示，被敲低lncRNA SNHG3 表達(dá)的SW480 細(xì)胞和LoVo 細(xì)胞的增殖均受到抑制（P均＜0.01）。

圖4 經(jīng)4 種方法處理的CRC 細(xì)胞系SW480 和LoVo中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平比較 A SW480 細(xì)胞 B LoVo 細(xì)胞

2.5 敲低SW480 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SHNG3 表達(dá)對(duì)Hedgehog 信號(hào)通路相關(guān)基因和E2F1 表達(dá)的影響

本研究檢測(cè)并比較了各組細(xì)胞中Hedgehog 信號(hào)通路相關(guān)基因和E2F1 的mRNA 表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與sh-Ctrl 組細(xì)胞相比，利用sh-SNHG3-1 轉(zhuǎn)染敲低lncRNA SNHG3 表達(dá)的sh-SNHG3-1 組細(xì)胞中Hedgehog 信號(hào)通路相關(guān)基因Smo、Gli1 和Ptch1及轉(zhuǎn)錄因子E2F1 的mRNA 表達(dá)水平均顯著降低 （P 均＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖5 敲 低CRC 細(xì) 胞 系SW480 和LoVo 中l(wèi)ncRNA SNHG3 表 達(dá) 對(duì)CRC 細(xì) 胞 增 殖 的 影 響 A SW480 細(xì)胞 B LoVo 細(xì)胞

圖6 敲低CRC 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3 表達(dá)對(duì)Smo、Gli1、Ptch1 和E2F1 mRNA 表達(dá)的影響

3 討論

CRC 是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)惡性腫瘤，有50%～ 60%的CRC 患者確診時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移，80%～90%的CRC 患者的肝轉(zhuǎn)移灶無(wú)法切除[9]。因此，尋找高敏感度和特異度的生物標(biāo)志物對(duì)于CRC 的診斷非常重要。

本研究分別比較了CRC 組織和CRC 細(xì)胞與癌旁組織和正常結(jié)腸組織細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)水平，分析CRC 組織中l(wèi)ncRNA SNHG3 表達(dá)水平與患者臨床病理特征及總生存率的相關(guān)性，結(jié)果提示lncRNA SNHG3 可以作為CRC 的生物標(biāo)志物和獨(dú)立預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)。

諸多研究顯示，SNHG3 可促進(jìn)多種腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移：SNHG3 可通過(guò)調(diào)節(jié)鄰近的MED18 基因甲基化來(lái)促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[10]；SNHG3過(guò)表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，其通過(guò)調(diào)節(jié)卵巢癌中的 GSK-3β/β-連環(huán)蛋白信號(hào)活性發(fā)揮促癌基因作用[11]；SNHG3 在乳腺癌中作為促癌基因發(fā)揮作用，其表達(dá)上調(diào)可抑制miR-384 活性并導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中肝癌衍生生長(zhǎng)因子（HDGF）過(guò)表達(dá)，從而調(diào)節(jié)miR-384/HDGF 通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲[12]；SNHG3 可通過(guò)沉默KLF2和p21 增強(qiáng)膠質(zhì)瘤的惡性生物學(xué)行為，促進(jìn)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[13]。CRC 相關(guān)研究顯示SNHG3 表達(dá)水平升高可促進(jìn)CRC 的進(jìn)展[14-15]，本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步探究了lncRNA SNHG3 的表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果與上述研究相符。

有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子E2F1 可誘導(dǎo)SNHG3的轉(zhuǎn)錄激活，之后通過(guò)激活TGF-β 信號(hào)通路和IL-6/JAK2/STAT3 信號(hào)通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移[16]。Pandoifi 等[17]的研究發(fā)現(xiàn)E2F1是Hedgehog 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵介質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)Gli1和Gli2 作為Hedgehog 信號(hào)的最終效應(yīng)因子，都通過(guò)與一個(gè)功能性非典型Gli 一致序列結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞中的E2F1 表達(dá)。上述研究說(shuō)明lncRNA SNHG3 與Hedgehog 信號(hào)通路之間很可能通過(guò)E2F1 發(fā)生相互作用，但目前尚無(wú)關(guān)于lncRNA SNHG3 與Hedgehog 信號(hào)通路相互作用的研究報(bào)道。

Hedgehog 信號(hào)通路是一個(gè)保守的通路，其通過(guò)調(diào)控細(xì)胞增殖和分化的時(shí)間和空間來(lái)指導(dǎo)胚胎發(fā)育模式[18]。Hedgehog 信號(hào)缺失可導(dǎo)致小鼠和人類發(fā)育過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重缺陷[19]。成人干細(xì)胞或祖細(xì)胞中的Hedgehog 信號(hào)通路可調(diào)節(jié)組織的穩(wěn)態(tài)、修復(fù)和再生[20]。不受抑制的Hedgehog 通路激活涉及多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21]。Watkins 等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，人小細(xì)胞肺癌組織和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中存在Hedgehog 通路信號(hào)分子SHH 和Gli1 的活化，Smo 抑制劑環(huán)巴胺能顯著抑制小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)。Park 等[23]的研究使用肺上皮中 Rb1 和 Trp53 缺失誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌小鼠模型，發(fā)現(xiàn)活化Smo 可促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的發(fā)生，Smo 缺失可抑制小細(xì)胞肺癌的發(fā)生和進(jìn)展，抑制Hedgehog 信號(hào)能有效預(yù)防化學(xué)治療后腫瘤復(fù)發(fā)。Tian 等[24]的研究報(bào)道Smo 抑制劑GDC-0449 能有效抑制非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖。Liu 等[25]的研究報(bào)道Hedgehog通路在CD44+CD24-/lowLin-乳腺癌干細(xì)胞中被激活，正常乳腺干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Gli2 可導(dǎo)致乳腺導(dǎo)管異型增生。Peng 等[26]的研究報(bào)道lncRNA EGOT 可通過(guò)Hedgehog 通路促進(jìn)胃癌發(fā)生。此外，許多研究證實(shí)了Hedgehog 信號(hào)通路可影響CRC 的發(fā)展、轉(zhuǎn)移和治療，其是CRC 預(yù)后的關(guān)鍵因素[27-29]。

本研究結(jié)果表明CRC 組織中l(wèi)ncRNA SNHG3的表達(dá)水平與Gli1 mRNA 表達(dá)水平呈正相關(guān)，并且敲低CRC 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA SNHG3 的表達(dá)可使Hedgehog 信號(hào)通路相關(guān)基因Smo、Gli1 和Ptch1及轉(zhuǎn)錄因子E2F1 的表達(dá)水平降低，提示lncRNA SNHG3 可能通過(guò)Hedgehog 信號(hào)通路發(fā)揮促進(jìn)CRC發(fā)展的作用。lncRNA SNHG3 與E2F1 及Hedgehog之間相互調(diào)節(jié)的具體機(jī)制有待進(jìn)一步探究。