老年克羅恩病患者腸組織中l(wèi)ncRNA CCAT1 的 表達與預后的關(guān)系

王 娟 解鳳妮

克羅恩?。–D）是一種慢性、復發(fā)性炎癥性腸?。↖BD），臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、腸炎和腸梗阻等。CD 的發(fā)病原因尚未明確，可能與遺傳、微生物和環(huán)境因素等導致的胃腸道免疫反應失調(diào)密切相關(guān)[1]。研究表明，CD 的發(fā)病率除了在30 歲左右的青年人群中存在高峰外，在60～80 歲的人群中存在第二高峰[2]。近年來，隨著中國人口老齡化問題的加劇，老年CD 患者的數(shù)量不斷增多。由于臨床醫(yī)師對老年CD 缺乏警惕性，易將其誤診為腸癌、闌尾炎等其他疾病。在臨床治療過程中，CD易反復發(fā)作，需要長期監(jiān)測患者的疾病活動。目前主要的監(jiān)測方式多為侵入性檢查，費用高且耗時，并不適合作為臨床常規(guī)檢查[3]。因此，亟需尋找一種新的、準確度較高的生物標志物。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度超過200 個堿基的非蛋白質(zhì)編碼轉(zhuǎn)錄本，在功能基因組學中屬于一種新型的調(diào)控基因。越來越多的證據(jù)表明，lncRNA 在細胞生長、發(fā)育、分化、凋亡等方面發(fā)揮著重要作用。結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（CCAT1）定位于人類染色體組8q24.21，其最初被證實作為癌基因在結(jié)腸癌組織中高表達[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1 在其他消化道腫瘤乃至肺腺癌、卵巢癌組織中也呈高表達[5]。Ma 等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，CCAT1 在炎性組織中表達上調(diào)，可通過miR-185-3p/肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）信號通路促使IBD 發(fā)病。本研究擬通過檢測CCAT1 在CD 患者炎性組織中的表達水平，分析其與患者預后的關(guān)系，以期為CD 患者的臨床治療及預后評估提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入研究的93 對樣本[包括炎性組織及炎性組織旁經(jīng)病理檢查證實的正常（非炎性）組織]選自2017 年3 月至2019 年3 月在空軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院經(jīng)腸鏡及病理診斷確診的CD 患者。CD的診斷標準參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012 年·廣州）》[7]。納入標準：（1）年齡＞60 歲；（2）接受了結(jié)直腸鏡檢查；（3）首次就診； （4）參與本研究的患者及家屬均對本研究知情，并簽署了知情同意書。排除標準：（1）合并急性感染性腸??；（2）合并心、肝、腎等重要器官功能障礙； （3）合并自身免疫性疾?。唬?）入組前服用了抗炎藥物。93 例患者中男性49 例，女性44 例，年齡61～85 歲，平均年齡為（66.28±12.37）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 臨床資料收集

收集患者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、病變部位（包括末端回腸、回腸、回結(jié)腸、上消化道、回結(jié)腸＋上消化道）、疾病行為（包括非狹窄非穿透型、狹窄型、穿透型）、有無肛周病變及治療方案等資料。

1.3 CCAT1 表達水平檢測

采用實時熒光定量PCR 法檢測CD 患者腸道炎性組織及正常組織中CCAT1 的表達水平。使用TRIzol 試劑提取CD 患者腸道炎性組織和正常組織標本中的總RNA，使用NanoDrop ND-2000 分光光度計測定RNA 的濃度和純度。使用PrimeScriptTMRT Master Mix 試劑盒將總RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用SYBR?Green PCR 試劑盒進行實時熒光定量PCR。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以U6 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCT法計算CCAT1 的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.4 隨訪

參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見（2012年·廣州）》[7]對患者進行常規(guī)治療，在患者出院1周后通過門診或電話的方式進行為期3 年的隨訪，每月隨訪1 次，隨訪截至2022 年3 月，終點事件為患者死亡?；颊咴? 年內(nèi)出現(xiàn)并發(fā)癥（腸梗阻、腸瘺、腹腔膿腫、腸穿孔、復雜肛瘺、消化道大出血）、行腸切除手術(shù)及發(fā)生CD 相關(guān)死亡等情況時，被認為是預后不良；若患者在就診后的3 個月內(nèi)出現(xiàn)上述情況，則不納入分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t 檢驗。計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素logistic 回歸法分析影響患者預后的危險因素。采用ROC 曲線評估CCAT1 判斷CD 患者預后的效能。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CCAT1 在CD 患者炎性組織及正常組織中的表達

實時熒光定量PCR 檢測結(jié)果顯示，CD 患者炎性組織中CCTA1 的相對表達量為5.21±0.46，顯著高于正常組織（1.01±0.09），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 預后良好組與預后不良組的基本資料比較

根據(jù)患者的預后情況將其分為預后良好組（n＝ 52）和預后不良組（n＝41）。兩組患者在性別、年齡、BMI 及病變部位方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05）。預后不良組中疾病行為為狹窄型及穿透型者、肛周病變者、首次治療時使用糖皮質(zhì)激素者的占比均高于預后良好組，差異均有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。見表2。

表2 預后良好組與預后不良組的基本資料比較

2.3 CCAT1 判斷CD 患者預后的效能

本研究結(jié)果顯示，預后不良組的炎性組織中CCAT1 的相對表達量為6.88±0.72，顯著高于預后良好組（4.03±0.48），兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。CD 患者炎性組織中CCAT1 的表達水平判斷CD 患者預后的ROC 曲線下面積（AUC）為0.932（95%CI：0.878～0.986），最大約登指數(shù)為0.826，最佳截斷值為5.33，敏感度為0.902，特異度為0.923。見圖1。

圖1 CCAT1 判斷CD 患者預后的ROC 曲線

2.4 影響CD 患者預后的危險因素分析

將CD 患者的預后情況作為因變量，將單因素分析中可能與CD 患者預后有關(guān)的項目（疾病行為、肛周病變、首次治療時使用糖皮質(zhì)激素、炎性組織中CCAT1 水平）作為自變量，納入多因素logistic回歸分析模型。結(jié)果顯示，疾病行為、肛周病變、首次治療時使用糖皮質(zhì)激素及炎性組織中CCAT1的水平均為影響CD 患者預后的獨立危險因素（P均＜0.05）。

3 討論

近年來，CD 的發(fā)病率在中國呈升高趨勢[8]，該疾病高昂的治療費用給患者的家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。令人遺憾的是，目前尚無能夠完全治愈CD 的方法。

表3 影響CD 患者預后的多因素logistic 回歸分析

lncRNA 廣泛表達于真核細胞中，可參與調(diào)控不同水平的基因表達，參與組蛋白修飾、染色體重排、轉(zhuǎn)錄激活與干擾等過程。研究表明，lncRNA參與了CD 的發(fā)病機制[9-10]。CCAT1 是一種長度為2 628 nt，與基因突變熱點區(qū)轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 相連的lncRNA。研究顯示，CCAT1 在結(jié)腸癌組織中的表達水平顯著高于正常結(jié)腸黏膜組織，且其異常的高表達能促進結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展[11]。IBD 被認為是結(jié)直腸癌的癌前病變，結(jié)腸上皮的慢性炎性反應可導致結(jié)腸癌的發(fā)生[12]。非肌肉肌球蛋白Ⅱ（NM Ⅱ）在腸道上皮屏障的調(diào)節(jié)中起重要作用，抑制其表達可增高腸上皮細胞的細胞旁通透性。NM Ⅱ的激活受到肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化的調(diào)節(jié)，Rho 相關(guān)激酶（ROCK）和肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）參與了這一過程，CCAT1 的過表達可通過激活MLCK 和MLC 磷酸化影響小腸黏膜的屏障功能[6,13-14]。由此推測，CCAT1 可通過上述機制參與IBD 的發(fā)生和發(fā)展。

本研究通過實時熒光定量PCR 檢測發(fā)現(xiàn)，CD患者炎性組織中CCAT1 的表達水平顯著高于正常組織，且預后不良組的炎性組織中CCAT1 的表達水平顯著高于預后良好組，這提示CD 患者炎性組織中CCAT1 的表達水平與預后有關(guān)。ROC 曲線分析結(jié)果顯示，炎性組織中CCAT1 水平預測CD 患者預后的AUC 為0.932，敏感度和特異度分別為0.902 和0.923，這提示CD 患者炎性組織中CCAT1的表達水平判斷患者預后情況具有較高的效能。多因素logistic 回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疾病行為、肛周病變及首次治療時使用糖皮質(zhì)激素均為影響CD 患者預后的獨立危險因素，這與李珍艷等[15]的研究結(jié)果相符；此外，本研究指出炎性組織中CCAT1 的表達水平也是影響CD 患者預后的獨立危險因素之一。

綜上所述，CD 患者炎性組織中CCAT1 的表達水平越高，提示患者發(fā)生預后不良的風險越高，檢測炎性組織中CCAT1 的表達水平有助于臨床醫(yī)生判斷患者的預后情況。本研究作為一項單中心、小樣本量的研究，結(jié)果具有一定的局限性。今后，課題組將開展多中心、大樣本研究進一步驗證本文的結(jié)論。