基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探析白芍-甘草治療強(qiáng)直性脊柱炎作用機(jī)制*

胡倩 李麗梅 王興強(qiáng) 王為 張春燕 湯小虎,**

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500;2.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032)

強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)是一種主要侵犯骶髂關(guān)節(jié)、脊柱骨突、脊柱旁軟組織及外周關(guān)節(jié)，并與人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)密切相關(guān)的全身性、慢性炎癥性疾病，影響著全球近0.1～0.5%的人口，由其引發(fā)的相關(guān)疼痛癥狀及韌帶骨化造成不可逆的功能障礙嚴(yán)重影響患者的工作和生活[1-2]。

目前西醫(yī)治療以減少炎癥反應(yīng)、防止或降低結(jié)構(gòu)破壞，改善功能為主[3]。臨床上使用非甾體抗炎藥物、糖皮質(zhì)激素、生物制劑等治療，雖取得一定的療效，其胃腸道反應(yīng)和潛在的毒副作用亦不容忽視，影響患者長期用藥[4]。中醫(yī)藥以其獨(dú)特的療效，在減輕疼痛、調(diào)節(jié)免疫、改善機(jī)體整體狀況等方面對AS有著積極的治療作用。

中醫(yī)歷代文獻(xiàn)并無“強(qiáng)直性脊柱炎”的病名，但根據(jù)類似AS的臨床癥狀、晚期表現(xiàn)為駝背畸形等特點(diǎn)，大部分醫(yī)家將AS冠以“痹證”“大僂”等名稱，認(rèn)為腎陽、督脈虧虛，外邪痹阻經(jīng)絡(luò)為其主要病因病機(jī)[5]。但不乏有醫(yī)家主張肝血不足，筋脈失其濡養(yǎng)、以致拘攣疼痛，在治療上強(qiáng)調(diào)舒筋通絡(luò)、解痙止痛[6]。

白芍-甘草是中醫(yī)緩急止痛的經(jīng)典配伍，最早見于張仲景《傷寒雜病論》[7]芍藥甘草湯，第26條：“傷寒脈浮，自汗出，小便數(shù)，心煩，微惡寒，腳攣急……更作芍藥甘草湯與之，其腳即伸?！痹摲剿幒喠Ｓ砂咨趾椭烁什輼?gòu)成，白芍酸苦微寒，益陰養(yǎng)血；炙甘草甘溫，補(bǔ)中緩急。二藥合用酸甘化陰，有滋陰養(yǎng)血、緩攣急、止疼痛的作用[8]。現(xiàn)代研究和臨床實(shí)踐也證實(shí)，芍藥甘草湯具有顯著的解痙[9]、抗炎[10]、鎮(zhèn)痛[11]、保護(hù)跟腱組織[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]等作用，對多種痙攣、疼痛、炎癥性疾病等都有顯著的治療作用[14]。在臨床研究中含有白芍-甘草藥對的烏頭湯、獨(dú)活寄生湯等在治療AS上取得了較好的療效[15-16]。但目前對白芍-甘草治療AS的有效作用是基于哪些主要成分及分子作用機(jī)制尚未見系統(tǒng)描述。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于人工智能和大數(shù)據(jù)時代藥物系統(tǒng)性研究的新興、交叉、前沿學(xué)科，其具有的整體性、系統(tǒng)性和綜合性的特點(diǎn)與中藥的多成分、多靶點(diǎn)、整體性高度相似，近年來運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中藥作用的分子機(jī)制已經(jīng)成為常用手段，為中藥復(fù)雜體系研究提供了新思路，為臨床合理用藥、新藥研發(fā)等提供了新的科技支撐[17-18]。

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探尋白芍-甘草治療AS可能的作用靶點(diǎn)及其作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1藥物化學(xué)成分及其相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP)，分別檢索白芍和甘草的所有活性成分，并根據(jù)中藥成分的 ADME(藥代動力學(xué))，設(shè)置過濾條件[19]：具有較高口服生物利用度即OB (Oral bioavailability)>30% 的分子和具有較好的類藥性即DL(Drug-likeness) >0.18 的分子。并在“Related Targets”欄目檢索并篩選白芍和甘草有效活性成分的作用靶點(diǎn)。

1.2AS疾病靶點(diǎn)及其與藥物交集靶點(diǎn)的獲取 通過人類基因數(shù)據(jù)庫(GeneCards)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、治療靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(TTD)、DrugBank數(shù)據(jù)庫，遺傳藥理學(xué)與藥物基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫(PharmGKb)，以“Ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞搜集疾病靶點(diǎn)。得到疾病相關(guān)的基因信息并刪除重復(fù)的靶點(diǎn)。將藥物和疾病靶點(diǎn)經(jīng)過Uniport數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一為蛋白質(zhì)ID格式后將其進(jìn)行對比匹配，獲得與白芍-甘草治療AS疾病相關(guān)的潛在作用靶點(diǎn)。

1.3核心靶點(diǎn)圖的構(gòu)建 將化合物和疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 在線平臺(https://string-db.org)，設(shè)置物種為人類(“Homo sapiens”)，最小交互值(“minimum required interaction score”) > 0.700。得到核心靶點(diǎn)數(shù)據(jù)、導(dǎo)出為TSV格式，并利用R軟件繪制條形圖，進(jìn)行結(jié)果的可視化。

1.4GO生物功能及KEGG信號通路富集分析 運(yùn)用Bioconductor平臺和R語言，對得到的藥物-疾病共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析，說明其在基因功能中的作用，并將其結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1白芍-甘草化合物及其相關(guān)靶點(diǎn) 初步篩選出藥物已知成分共365種，其中通過過濾條件，計105個，其中白芍13 個，甘草 92 個。整合TCMSP 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，以及通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化，刪除重復(fù)值后共獲得 214 個化合物相關(guān)潛在靶點(diǎn)。

2.2疾病靶點(diǎn)搜索結(jié)果 共獲得疾病靶點(diǎn)2519個，其中TTD數(shù)據(jù)庫11個，PharmGKb數(shù)據(jù)庫3個，OMIM數(shù)據(jù)庫103個，GeneCards數(shù)據(jù)庫2011個，DrugBank數(shù)據(jù)庫391，刪除重復(fù)值，最終獲得AS疾病靶點(diǎn)共2137個。與白芍-甘草藥物活性成分潛在靶點(diǎn)對比匹配，共獲得TNF、IL6、CD14、PTGS1、PTGS2等80個交集靶點(diǎn)，韋恩圖(見圖1)。通過與白芍-甘草105個活性成分匹配后，得到87個具有治療AS作用的活性成分。

圖1 交集靶點(diǎn)

2.3中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將87個活性成分及80個交集靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，構(gòu)建中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，具體見圖2，圖中紅色為白芍的化合物，綠色為甘草的化合物，黃色為靶點(diǎn)，并對該網(wǎng)絡(luò)圖中的化合物節(jié)點(diǎn)的度值(Degree)進(jìn)行分析，Degree在活性成分節(jié)點(diǎn)表示該活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)個數(shù)，意味著度值越大，該活性成分在治療AS的過程中所發(fā)揮的作用也越大，可得出前5位關(guān)鍵化合物為槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、柚皮素(naringenin)、鉤藤酮a(licochalcone a)、7-甲氧基-2-甲基異黃酮(7-Methoxy-2-methyl isoflavone)分別能與55、23、19、15、12個關(guān)鍵靶點(diǎn)連接，對治療AS具有重要的意義，具體見表1，選取度值 > 10的活性成分進(jìn)行展示。

圖2 中藥-化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 “白芍-甘草”治療AS的主要活性成分

2.4核心靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 將80個共同靶基因?qū)胫罶TRING，利用R軟件繪制條形圖，展示Degree排名前30的靶點(diǎn)，見圖3，其中Degree值較高的為核心基因，由圖可見白細(xì)胞介素-6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、血管內(nèi)皮生長因子-A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶-3(MAPK3)、白細(xì)胞介素1B(IL-1B)等基因排名靠前，其中TNF(Degree54)和IL6(Degree59)和為白芍-甘草治療AS最相關(guān)的候選靶點(diǎn)。

圖3 PPI中的核心基因(前20)

2.5靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 使用R軟件對80個共同靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，設(shè)置閾值P<0.05，對P值排序后進(jìn)行分析并對其結(jié)果進(jìn)行可視化，由結(jié)果可見白芍-甘草參與的通路主要有IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等，見圖4。其中生物學(xué)過程(Biological Process)1820條，分子功能(Molecular Function)119條，細(xì)胞組成(Cellular Component)25條。參與生物過程包括脂多糖應(yīng)答(response to lipopolysaccharide)、對細(xì)菌來源的分子反應(yīng)(response to molecule of bacterial origin)、類固醇代謝過程(steroid metabolic process)、對有毒物質(zhì)的應(yīng)答(response to toxic substance)、對生物刺激的細(xì)胞免疫應(yīng)答(cellular response to biotic stimulus)等。分子功能中與核受體活性配體激活(nuclear receptor activity ligand-activated)、DNA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合和轉(zhuǎn)錄因子活性(transcription factor activity DNA-binding transcription factor binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)等密切相關(guān)。在細(xì)胞組成中細(xì)胞膜膜筏(membrane raft)、膜微區(qū)(membrane microdomain)、膜區(qū)(membrane region)、質(zhì)膜外側(cè)面(external side of plasma membrane)比例最大。見圖5。

圖4 KEGG通路富集分析

圖5 BP、CC、MF分析柱狀圖

3 討論

本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)白芍-甘草治療AS最主要的成分為槲皮素、山柰酚，其中山柰酚為白芍-甘草共同的成分，槲皮素為甘草的主要成分，兩者均為黃酮類化合物。近年來黃酮類化合物被認(rèn)為是天然藥物中最有效的成分，在體內(nèi)外均有改善炎癥的作用[20]。其中山奈酚通過抑制環(huán)氧合酶(COX)通路的活性來抑制花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到較好的抗炎鎮(zhèn)痛作用[21]。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)其能顯著降低炎癥生物標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白(CRP)和炎癥因子IL-6、TNF的表達(dá)[22]。槲皮素具有抗炎、抗感染、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性[23]。研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過減弱由吲哚美辛誘導(dǎo)的核因子κB(NF-κB)的活化及白細(xì)胞介素-8(IL-8)的產(chǎn)生從而抑制胃腸道黏膜黏附分子表達(dá)和中性粒細(xì)胞浸潤、達(dá)到預(yù)防或治療非甾體抗炎藥關(guān)于胃腸道的副作用，同時不影響TNF-α介導(dǎo)的前列腺素E2的抑制作用，能在一定程度上增強(qiáng)非甾體抗炎藥物的抗炎活性[24]。

AS導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)改變的病理過程可分為炎癥、骨侵蝕、新骨形成三個階段，每個階段的效應(yīng)通路都可能與TNF有關(guān)，有研究表明TNF對于骨穩(wěn)態(tài)的作用可能與其局部濃度有關(guān)，低濃度下通過上調(diào)Runx2、骨鈣素和堿性磷酸酶水平來增加成骨分化，觸發(fā)骨增殖和新骨形成[25]。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法發(fā)現(xiàn)TNF、IL-6和PTGS2為白芍-甘草治療AS最相關(guān)的靶點(diǎn)。早期使用腫瘤壞死因子抑制劑(TNFi)如阿達(dá)木單抗(ADA)等，可以減輕患者外周關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學(xué)改變、減少AS患者髖關(guān)節(jié)放射學(xué)進(jìn)展[26-27]。IL-6是處于TNF下游的促炎細(xì)胞因子，參與著促炎和抗炎通路、代謝控制、骨代謝、神經(jīng)修復(fù)和再生過程，在多種惡性腫瘤的調(diào)節(jié)和生長中發(fā)揮重要作用[28-29]。既往研究表明TNF-α、IL-1β和IL-6在AS患者血清中明顯上調(diào)，這些炎癥因子的釋放加速了強(qiáng)直性脊柱炎的發(fā)展[30-31]。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase,COX2)是誘導(dǎo)型酶，由PTGS2基因編碼，是AS炎癥通路啟動的關(guān)鍵酶，主要參與前列腺素和血栓素的生物合成，并將花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素H2，通過降低相關(guān)炎癥因子的表達(dá)、阻斷前列腺素的產(chǎn)生，可減輕炎癥反應(yīng)、緩解臨床癥狀[32-33]。

KEGG富集分析結(jié)果顯示，白芍-甘草治療AS可能通過IL-17、TNF、NF-κB、Toll樣受體等信號通路發(fā)揮作用，其中IL-17信號通路被認(rèn)為參與了AS發(fā)病的炎癥和新骨形成過程[34]。AS的發(fā)病機(jī)制涉及單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞[35-36]。其中由T細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17細(xì)胞因子水平在AS患者的關(guān)節(jié)組織中明顯升高，且通過抗IL-17抗體阻斷IL-17A的功能，可阻止SKG(自發(fā)型類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)小鼠脊柱中AS樣特征的發(fā)展[37-38]。IL-17可靶向多種細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)，從而造成關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生[39-40]，這些細(xì)胞因子一方面擴(kuò)大了滑膜的炎癥，另一方面也激發(fā)了骨的過度修復(fù)反應(yīng)，造成了新骨的形成。已有研究證明IL-17可能通過激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的MMPs和成骨細(xì)胞呈現(xiàn)的NF-κB配體受體激活劑(RANKL)來影響骨代謝[41]。

綜上所述，白芍-甘草可能通過多成分多靶點(diǎn)多通路抑制新骨形成、降低炎癥反應(yīng)和炎癥因子等作用，從而延緩病情發(fā)展及改善患者生活質(zhì)量。但由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法存在一定的局限性，白芍-甘草基于中醫(yī)理論柔肝緩急、以助舒筋，對于其是否具有緩解韌帶骨化方面還需進(jìn)一步研究證明。通過本文的研究提示：具有柔肝緩急的白芍-甘草的配伍結(jié)構(gòu)，在防治AS患者韌帶骨化方面提供了思路。