連續(xù)施用改性生物質炭對鎘鉛土壤修復效果及其對微生物群落結構的影響

楊素勤，魏森，張彪*，李煊楨，張玉鵬，馬振華，寧欣杰，魏宏楊

（1.河南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，鄭州 450002；2.河南農業(yè)大學林學院，鄭州 450002）

施用土壤調理劑是降低土壤有效態(tài)重金屬含量和作物吸收量的可行措施。在諸多土壤調理劑中，生物質炭的應用前景廣闊。生物質炭是生物質原料在限氧條件下得到的熱解產物，主要通過吸附或螯合等方式來降低重金屬的毒害作用，改善土壤理化性質。生物質炭可通過土壤pH、土壤有機質以及微生物群落組成等多種機制的協(xié)同作用影響重金屬有效性。在大田條件中，兩種以上重金屬的復合污染較為常見，僅施用單一調理劑難以達到理想的穩(wěn)定效果，而配施不同調理劑可解決這一問題。有研究發(fā)現(xiàn)，生物質炭和磷酸鹽配合施用對鉛鈍化的效果好于單一施用兩種固化劑。相比于生物質炭，含磷物質能通過沉淀等方式明顯降低鉛等重金屬的活性。研究證實，含磷化合物可以降低土壤中鉛的生物有效性，鉛可與磷在氯離子存在條件下形成極穩(wěn)定的磷氯鉛礦[Pb（PO）Cl]，明顯降低植物對鉛的吸收。磷酸鹽的溶解性是制約其鈍化修復鉛污染土壤的重要因素，水溶性磷酸鹽能夠有效降低鎘、鉛、鋅等重金屬的生物有效性，研究表明，水溶性磷酸鹽在降低重金屬的生物有效性上效果好于難溶性磷酸鹽。當土壤中加入水溶性磷酸鹽時，土壤溶液中形成的PO可以與Cd和Pb形成磷酸鹽沉淀。

土壤微生物對重金屬脅迫的敏感程度大于動植物，因此可用于預測土壤生態(tài)系統(tǒng)及環(huán)境質量的變化，及時反映土壤污染狀況。在重金屬污染土壤中，微生物會在數量、多樣性和群落結構等方面有所響應。BRUCE的研究表明，農田土壤中過多的重金屬會顯著降低土壤微生物的多樣性。陳兆進等通過對新鄉(xiāng)市鎘污染土壤細菌群落組成及其對鎘固定效果的研究發(fā)現(xiàn)，隨著鎘污染的加重，芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬等高效固定重金屬的細菌逐漸占據優(yōu)勢。生物質炭可以將微生物吸附到其表面，作為微生物棲息的微環(huán)境，從而減少微生物的生存競爭。姚欽的研究表明生物質炭對門水平的真菌群落結構沒有顯著影響，但是改變了屬水平上真菌群落的結構。通常微生物對土壤環(huán)境變化有很強的敏感性，施磷可改變作物根系生長和養(yǎng)分吸收等過程。向君等的研究表明，施磷能增加干旱脅迫下箭竹根際土壤養(yǎng)分含量和微生物生物量，改善根際土壤微生物群落結構。而短期磷添加顯著增強了土壤微生物對碳源的利用能力，一定程度上提高了土壤微生物群落功能多樣性。通常認為，土壤中微生物多樣性越高，其抗環(huán)境脅迫能力和作物生產能力就越強。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗點位于豫北某地鉛冶煉企業(yè)周邊污染農田。該區(qū)域屬暖溫帶大陸性季風氣候，年平均氣溫14.5℃，年均降水量567.9 mm，土壤基本理化性質見表1。土壤pH＞7.5，鎘、鉛含量均高于《土壤環(huán)境質量農用地土壤污染風險管控標準（試行）》（GB 15618—2018）中規(guī)定的農用地土壤污染風險篩選值（鎘0.6 mg·kg、鉛170 mg·kg），但低于風險管控值（鎘4.0 mg·kg、鉛1 000 mg·kg），屬于安全利用類耕地。

表1 供試土壤理化性質和重金屬含量Table 1 Physical and chemical properties and heavy metal content of the tested soil

土壤調理劑為磷酸改性稻殼生物質炭，pH 5.5，可提取態(tài)磷含量750 mg·kg，鉛含量1.75 mg·kg，鎘含量0.08 mg·kg，比表面積76.6 m·g。每年的施用量為11.19 t·hm。

試驗設置不施用調理劑的對照（CK）、2015—2016年施用2 a調理劑后停施（Y）、2015—2017年連續(xù)施用3 a后停施（Y）、2015—2018年連施4 a后停施（Y）、2015—2019年連施5 a后停施（Y），共5個處理，每個處理4次重復。

為對比土壤調理劑對環(huán)境質量的影響，對所采土壤樣品進行高通量測序分析。采集0～20 cm表層土壤充分混勻，部分土壤樣品裝于無菌袋中，用冰塊冷凍保存后帶回實驗室保存在-80℃冰箱內，用于土壤微生物多樣性和群落結構的測定；其余土壤樣品風干后研磨過篩，用于土壤理化性質的測定。小麥成熟期采集籽粒樣品，帶回實驗室后洗凈、烘干并粉碎。

1.2 測定方法

土壤pH用2.5∶1水土比浸提后使用pH計測定；堿解氮使用堿解擴散法測定；速效磷采用0.5 mol·LNaHCO浸提-鉬藍比色法測定；速效鉀采用1 mol·L中性NHOAC浸提-火焰光度計法測定；土壤有效態(tài)鎘、鉛含量用DTPA浸提-原子吸收分光光度法測定；小麥籽粒鎘、鉛含量用HNO-HClO消解后使用石墨爐原子吸收分光光度計法測定。

采用高通量測序技術對土壤樣品的微生物群落結構進行檢測，采用引物338F（5'-ACTCCTACGGG AGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3'）對細菌的16S rRNA的V3～V4區(qū)進行擴增，采用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGG AAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCG ATGC-3'）對真菌的ITS1區(qū)進行擴增。擴增得到的PCR產物用QuantiFluor-ST藍色熒光檢測系統(tǒng)進行定量，樣品按照測序要求混合均勻。高通量測序在上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，數據處理借助美吉生物云平臺進行。

1.3 數據統(tǒng)計及分析

使用Origin 2018和SPSS 21.0進行數據整理、制圖與統(tǒng)計分析，Duncan法多重比較檢驗各因素處理間的差異顯著性（＜0.05）。微生物試驗數據分析前按最小樣本序列數進行抽平處理。主成分分析利用R語言（version 3.3.1）PCoA統(tǒng)計分析并制圖；群落熱度圖（Heatmap）的軟件及算法采用R語言（version 3.3.1）vegan包的方法；組間差異顯著性檢驗分析采用Wilcox秩和檢驗（Wilcoxon rank-sum test）；環(huán)境因子關聯(lián)分析利用R語言vegan包中的RDA分析并制圖。

2 結果與分析

2.1 改性生物質炭對土壤pH的影響

相比于CK，本研究中改性生物質炭的施用均降低了土壤pH，不同處理土壤pH的降幅可達0.27～0.57；隨著施用年限的延長，土壤pH呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢（圖1）。

圖1 調理劑施用對土壤pH的影響Figure 1 Effect of modifier application on soil pH

2.2 改性生物質炭對土壤有效態(tài)鎘、鉛含量及小麥籽粒鎘、鉛含量的影響

與CK相比，施加調理劑后土壤有效態(tài)鎘、鉛含量均明顯降低（圖2）。其中，有效態(tài)鎘含量最低為0.54 mg·kg，降幅達到46%，有效態(tài)鉛含量最低為43.5 mg·kg，降幅達到36%。連續(xù)施用調理劑2 a后土壤有效態(tài)鎘、鉛含量即顯著降低，之后隨著連續(xù)施用年限的增加降低幅度有所減??；Y處理有效態(tài)鎘含量最低，而Y、Y和Y處理間沒有顯著差異；Y處理土壤有效態(tài)鉛含量最低，Y、Y和Y處理間沒有顯著差異。

圖2 各處理土壤有效態(tài)鎘、鉛含量Figure 2 Contents of soil available Cd and Pb in different treatments

各處理小麥籽粒鎘、鉛含量如圖3所示。與CK相比，施加調理劑的各處理小麥籽粒鎘含量顯著下降。隨著調理劑施用年限的增加，小麥籽粒鎘含量呈不斷下降的趨勢，但所有處理下均超出《食品安全國家標準食品中污染物限量》（GB 2762—2017）規(guī)定的限值；Y處理籽粒鎘含量最低，與CK相比降低幅度達到43%，而Y、Y和Y處理間差異不顯著。對小麥籽粒中鉛而言，所有處理均未超過GB 2762—2017規(guī)定的限值，與CK相比，Y處理籽粒鉛含量未達到顯著差異，Y處理籽粒鉛含量顯著降低，與CK相比降低幅度達到35%，而Y、Y和Y處理間差異不顯著。

圖3 各處理籽粒鎘、鉛含量Figure 3 Contents of Cd and Pb in grains in different treatments

2.3 改性生物質炭對微生物多樣性的影響

各處理細菌和真菌Alpha多樣性指數如表2所示。施用土壤調理劑對細菌多樣性的影響大于真菌。對細菌來說，相比于CK，各處理Shannon指數均增加，而Simpson指數則均有所降低，說明土壤細菌的多樣性增加；Chao指數、Ace指數均顯著升高，表明土壤細菌群落的多樣性及豐富度均增加；但Y、Y和Y處理與Y處理相比并沒有進一步增加細菌多樣性和豐富度。各處理真菌多樣性與CK相比雖有上升，但差異并不顯著。

表2 各處理細菌和真菌Alpha多樣性指數Table 2 Alpha diversity index of bacteria and fungi in different treatments

主坐標分析（PCoA）可以通過對不同微生物群落間的物種多樣性進行組間比較分析，探索不同分組樣本間群落組成的相似性或差異性。細菌群落組成相似度越高，在PCoA圖中的距離越近。細菌和真菌屬水平上PCoA分析結果如圖4所示，CK處理的微生物種群單獨分布，與其他處理的細菌群落結構表現(xiàn)出較大的差異性；而施加調理劑的4個處理土壤微生物群落組成較為相似。

圖4 屬水平上土壤細菌和真菌群落PCoA分析Figure 4 PCoA analysis of soil bacterial and fungal communities at genus level

2.4 改性生物質炭對土壤微生物群落結構的影響

將微生物按樣本間豐度的相似性進行聚類，使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，呈現(xiàn)群落物種組成及物種的豐度信息，并通過顏色的變化展示細菌群落組成的相似性和差異性。其中，紅色越深代表豐度越高，藍色越深代表豐度越低。

各處理豐度前30的細菌屬群落熱度圖與聚類樹如圖5a所示。其中，、為豐度最高的菌屬，（芽孢桿菌屬）、、（蓋氏菌屬）、（鞘氨醇單胞菌屬）、（鏈霉菌屬）、（節(jié)桿菌屬）和（類諾卡氏菌屬）等菌屬的豐度變化較為明顯。

各處理豐度前30的真菌屬群落熱度圖與聚類樹如圖5b所示。豐度最高的菌屬為（被孢霉屬）、（裂殼屬）、（赤霉菌屬）。與CK相比，、、、和等菌屬的豐度均有所提升，而、、和等菌屬的豐度則明顯降低。

圖5 屬水平上細菌和真菌群落結構及分布Figure 5 Structure and distribution of bacterial and fungal communities at genus level

2.5 土壤微生物的屬水平差異分析

由于施用調理劑的成分一致，因此本研究將所有調理劑處理的細菌和真菌群落結構合并后視為一個處理（CT），與對照（CK）處理進行組間差異顯著性檢驗分析，基于群落豐度數據，展示微生物群落中群落豐度差異顯著的前15個菌屬。

細菌組間差異顯著性檢驗結果如圖6a所示，與CK相比，施用土壤調理劑后、、、、、（苔蘚桿菌屬）、（大理石雕菌屬）和等菌屬的豐度顯著降低，、、、（假雙頭斧形菌屬）、、（慢生根瘤菌屬）和等菌屬的豐度顯著升高。

真菌組間差異顯著性檢驗結果如圖6b所示，與CK相比，（被孢霉屬）、（籃狀菌屬）、、（腐質霉屬）、（樹粉孢屬）、（木霉屬）、（瓶毛殼屬）和（綠僵菌屬）等菌屬的豐度顯著升高，而、、、、（帚枝霉屬）、（柄孢殼屬）和等菌屬的豐度顯著降低。

圖6 細菌和真菌豐度差異顯著物種Figure 6 Species with significant differences in bacterial and fungal abundance

2.6 環(huán)境因子對微生物的驅動作用

為了進一步明確環(huán)境因子影響土壤菌群的驅動機制，對屬分類水平的主要細菌、真菌群落豐度與土壤理化因子進行Pearson相關分析，結果如表3所示。在優(yōu)勢細菌屬中，與土壤有效態(tài)鎘含量呈顯著負相關；與調理劑施用年限呈顯著負相關；與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著正相關，與土壤pH呈極顯著正相關，與調理劑施用年限呈極顯著負相關；與調理劑施用年限呈顯著正相關，與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈極顯著負相關。在優(yōu)勢真菌屬中，與土壤有效態(tài)鉛含量呈顯著負相關，與土壤有效態(tài)鎘含量呈極顯著負相關；與土壤有效態(tài)鉛含量呈顯著正相關，與土壤pH和有效態(tài)鎘含量呈極顯著正相關，與調理劑施用年限呈極顯著負相關；與有效態(tài)鎘含量呈顯著正相關，與土壤pH呈極顯著正相關，與調理劑施用年限呈顯著負相關；與調理劑施用年限呈顯著正相關，與土壤pH和有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著負相關。

表3 優(yōu)勢菌群與環(huán)境因子的相關性分析Table 3 Correlation analysis between dominant microflora and environmental factors

3 討論

3.1 改性生物質炭對土壤及小麥籽粒鎘、鉛的影響

本研究中，施入改性生物質炭后，土壤有效態(tài)鎘、鉛含量均顯著降低。施用4 a處理中，土壤pH達到最低；有效態(tài)鎘含量在施用5 a處理中達到最低，有效態(tài)鉛含量在施用4 a處理中達到最低，說明調理劑的連續(xù)施用可以進一步降低重金屬活性。本研究中各處理均降低了作物籽粒中鎘含量，但小麥鎘含量均未達到GB 2762—2017的限值要求，應進一步聯(lián)合種植低積累品種等措施來實現(xiàn)農產品安全生產。本研究中所有處理下的小麥籽粒鉛含量均符合國家標準，其中Y處理鉛含量未顯著減少，其他各處理（Y、Y和Y）與CK相比均顯著降低了鉛污染風險，但3個處理之間的差異不顯著。

3.2 改性生物質炭對土壤細菌多樣性及群落結構的影響

微生物多樣性和群落結構一定程度上反映了生態(tài)系統(tǒng)的健康和穩(wěn)定，是評價土壤質量的重要指標。大量研究表明，土壤微生物受土壤理化性質和土壤重金屬等環(huán)境因素影響。土壤pH是制約土壤微生物活動和作物生長的主要因素之一，pH過高的土壤不利于作物根系和根際微生物的生長。此外，重金屬可抑制土壤微生物的生長繁殖，對其群落結構和功能產生顯著的影響。向石灰性污染土壤中施用適量的改性生物質炭后，部分土壤pH降低，使得土壤中部分細菌和真菌的豐度增加，同時土壤有效態(tài)鎘、鉛含量降低，從而提升了土壤微生物多樣性，生物質炭豐富的孔隙結構為微生物提供了良好的棲息環(huán)境，有利于土壤微生物的定殖，并能有效減少微生物之間的生存競爭；生物質炭豐富的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素可以為微生物提供養(yǎng)分來源，提高土壤微生物的活力，促進土壤微生物多樣性的恢復。因此，在重金屬污染土壤中施用改性生物質炭可以通過改善土壤理化性質為微生物提供生存空間和養(yǎng)分物質，同時降低土壤重金屬對微生物的毒性。土壤的基本性質、重金屬的有效性及改性生物質炭的交互作用可對微生物多樣性和群落結構產生直接或間接的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)各處理中豐度較高的細菌菌屬均為、和。其中是土壤中常見的豐度較高且具有解磷能力的細菌類群，其分泌的次生代謝物能夠誘導植物產生抗病性，具有較強的促生作用。調理劑的施用改變了土壤細菌的群落結構，土壤中、（假雙頭斧形菌屬）、、（慢生根瘤菌屬）、等細菌菌屬的豐度顯著提升，（類諾卡氏菌屬）、（苔蘚桿菌屬）、（大理石雕菌屬）等菌屬的豐度則顯著下降。就本研究中豐度顯著增加的菌屬而言，是植物根際的有益細菌，與土壤有機質的含量密切相關，其能促進植物對激素、生物堿及氮的代謝過程；是重要的固氮細菌，可將大氣中的N固定轉化為土壤氮源。本研究中豐度顯著降低的菌屬中，作為一種嗜鹽放線菌，可在極端環(huán)境下生存，與銅、鋅、鎘、砷等重金屬均呈現(xiàn)出顯著正相關關系，其豐度改變可能是對土壤重金屬含量變化的應激反應。有研究表明，與是潛在有益菌，可以促進作物生長，提高作物抵抗病害的能力，但在本研究中這兩種細菌豐度均有所下降。與CK相比，各處理（節(jié)桿菌屬）的豐度變化雖不顯著，但可從熱度圖中看出其豐度明顯降低，這與陳兆進等的研究結果一致。本研究相關性分析結果也表明，的豐度與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈極顯著負相關，的豐度與土壤pH呈極顯著正相關，與調理劑施用年限呈顯著負相關。此外，本研究發(fā)現(xiàn)、、等部分未分類細菌也與土壤理化因子存在顯著相關關系，這些還需進一步驗證研究。

3.3 改性生物質炭對土壤真菌多樣性及群落結構的影響

大多數真菌在土壤中扮演分解者的角色，在土壤能量傳遞、物質循環(huán)等方面具有不同的作用和特性，70%左右的植物侵染性病害都是由真菌引起的。本研究中，土壤調理劑對真菌的多樣性指數沒有顯著的影響，這與殷全玉等的研究結果相似。改性生物質炭改變了真菌的群落結構，顯著增加了（被孢霉屬）、（籃狀菌屬）、和（腐質霉屬）的豐度，同時顯著降低了（赤霉菌屬）、（裂殼屬）和（帚枝霉屬）等菌屬的豐度。本試驗豐度顯著增加的菌屬中，是土壤中植物殘體的重要分解菌，可通過分解植物殘體提升土壤養(yǎng)分狀況；具有產纖維素酶活性，能夠降解木質纖維素，且對植物病原菌有拮抗作用。除此之外，部分可向土壤中分泌揮發(fā)性有機物，促進幼苗生長并增強抗病性；也會產生熱穩(wěn)定性纖維素酶、半纖維素酶、木質素酶等，具有促進纖維素分解的作用。本試驗豐度顯著降低的菌屬中，會導致小麥赤霉病，直接降低小麥產量和品質，最終通過食物鏈對人體健康產生危害；而能在小麥上廣泛定殖，并產生抑制赤霉病菌的次生代謝物。本研究相關性分析結果表明，與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著負相關，與調理劑施用量呈顯著正相關，但與土壤pH和有效態(tài)鎘、鉛含量呈顯著負相關，與有效態(tài)鎘含量和土壤pH呈顯著正相關，卻與調理劑施用年限呈顯著負相關。本研究還發(fā)現(xiàn)未分類的真菌與土壤有效態(tài)鎘、鉛含量都存在顯著正相關關系。

4 結論

（1）施用改性生物質炭顯著降低了小麥籽粒鎘、鉛含量。與對照相比，連續(xù)施用調理劑2 a即顯著降低小麥籽粒鎘含量，隨著施用年限的增加，籽粒鎘含量進一步降低；施用3 a后小麥籽粒鉛含量與對照相比顯著降低，隨著施用年限的繼續(xù)增加，鉛含量不再顯著降低。施用改性生物質炭后，土壤有效態(tài)鎘、鉛含量的變化與籽?；疽恢隆?/p>

（2）施用改性生物質炭可顯著增加土壤細菌群落的多樣性及豐富度，但對真菌多樣性的影響較??；相比于真菌，生物質炭能更大程度減輕鎘、鉛對細菌的毒害，促進污染土壤微生物多樣性的恢復；施用改性生物質炭年限不同，多樣性指數雖有改變，但差異不顯著。

（3）施用改性生物質炭顯著提升了細菌中、和真菌中的豐度；降低了細菌中、和真菌中、的豐度，在一定程度上改善了土壤生態(tài)環(huán)境。