L-天冬氨酸納米鈣促進(jìn)油菜生長的機理機制

侯佳玉，閆磊，2，程錦，曾紫君，張雅茹，魯克嵩，姜存?zhèn)}，3*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院微量元素研究中心，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院園藝植物生物學(xué)教育部重點實驗室，武漢 430070；3.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆 石河子 832000）

天然或人工生產(chǎn)的納米材料因其獨有的聲、光、熱、力、電化學(xué)性質(zhì)及比表面積大的特點，被廣泛應(yīng)用于電子、醫(yī)藥、涂料、環(huán)境修復(fù)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。與此同時，納米材料被釋放到土壤中，附著在植物根系表面，進(jìn)而被吸收、轉(zhuǎn)運、積累在植物各組織中，影響植物的生長發(fā)育。近年來研究發(fā)現(xiàn)，納米材料應(yīng)用到農(nóng)業(yè)上會對種子萌發(fā)、幼苗活力、根系生長和光合作用等產(chǎn)生影響，可以通過調(diào)控植物體內(nèi)關(guān)鍵代謝酶活性及相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)而提高植物對環(huán)境的適應(yīng)性，而且納米材料對植物生長產(chǎn)生的影響受其粒徑、濃度和作用時間的影響。已有研究表明，適宜濃度納米材料對植物的生長產(chǎn)生促進(jìn)作用，而高濃度納米材料對植物的生長產(chǎn)生抑制作用。納米二氧化鈦會促進(jìn)油松（）、黑麥草（）、高羊茅（）、苦草[（Lour.）]、黃瓜（L）和杉木[（Lamb.）]的植株生長和種子萌發(fā)，相反，當(dāng)納米二氧化鈦濃度較高時會抑制植物生長。50 mg·L納米氧化鐵會對豇豆[（Linn.）]幼苗生長產(chǎn)生促進(jìn)作用，而當(dāng)濃度達(dá)到100 mg·L時則會產(chǎn)生抑制作用，并且會在豇豆莖部積累納米氧化鐵。近期有研究指出，高濃度納米氧化鋅會抑制櫻桃蘿卜（L）、綠豆芽[（L.）]、花葉蘆竹（）、黑麥草及玉米（L）植株生長，且其對植株產(chǎn)生的毒害作用隨濃度的增加而增強。

鈣（Ca）是植物生長所必需的元素之一，在調(diào)控植物生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境脅迫方面具有重要的作用，其在植物體內(nèi)以長距離運輸為主，運輸能力與蒸騰強度的大小有關(guān)，因此老葉部位常有Ca積累，幼嫩部位出現(xiàn)缺Ca現(xiàn)象，嚴(yán)重影響幼葉的生長發(fā)育，故及時供應(yīng)鈣肥可以緩解作物缺鈣。常見的鈣肥有硫酸鈣（CaSO）、磷酸一鈣[Ca（HPO）·HO]、氯化鈣（CaCl）和碳酸鈣（CaCO）等。磷酸一鈣易轉(zhuǎn)化為磷酸二鈣、磷酸三鈣，供鈣強度較低；氯化鈣會造成土壤鹽漬化；碳酸鈣在酸性土壤中才能發(fā)揮良好的補鈣作用。因此，螯合鈣作為一種新型肥料逐漸受到重視。據(jù)報道，葉面噴施螯合鈣可以顯著提高葡萄（L.）、黃金梨（‘’）、藍(lán) 莓（Spp）、蘋 果（Mill）的產(chǎn)量和品質(zhì)，提升烤煙（Flue cured Tobacco）煙葉品質(zhì)，增加烤后煙葉的經(jīng)濟(jì)效益。

L-天冬氨酸納米鈣[Ca（L-asp）-NPs]溶解性好、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、易于吸收，是一種納米級氨基酸螯合鈣，與普通螯合鈣相比，對環(huán)境風(fēng)險小且廣泛應(yīng)用于人體鈣強化劑，但是它對作物生長的影響以及能否作為新型納米肥料應(yīng)用在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中尚需研究。劉亞林等研究發(fā)現(xiàn)，施用Ca（L-asp）-NPs會抑制棉花生長，但80 mg·LCa（L-asp）-NPs顯著促進(jìn)枳殼砧木的生長。然而Ca（L-asp）-NPs對油菜生長的影響鮮有研究，因此本研究通過探究不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜生長及生理特性的效應(yīng)，明確適宜油菜生長的Ca（L-asp）-NPs濃度，進(jìn)一步解析其在植物體內(nèi)的生理機制，為新型納米肥料應(yīng)用于生產(chǎn)提供相關(guān)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2021年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室進(jìn)行，試驗材料為“大地199”甘藍(lán)型油菜（）。挑選300顆飽滿一致的種子放在鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，自來水浸泡2 h后倒出，加1/3培養(yǎng)皿的超純水，用錫箔紙包住蓋好的培養(yǎng)皿后在4℃冰箱春化4 h。將春化好的種子放在30℃恒溫培養(yǎng)箱中，黑暗條件下培養(yǎng)24 h。待種子發(fā)芽后，均勻移在紗布上，用純水培養(yǎng)。光照培養(yǎng)室溫度設(shè)定為22℃，光照周期設(shè)定為14 h（光照）/10 h（黑暗），光照強度設(shè)定為300～320μmol·m·s。待根長至4～5 cm，將長勢均勻的幼苗移栽到4 L的黑色塑料盆中培養(yǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

共設(shè)6個處理，Ca（L-asp）-NPs分別為NPS-0（0 mg·L）、NPS-25（25 mg·L）、NPS-50（50 mg·L）、NPS-75（75 mg·L）、NPS-100（100 mg·L）以及Ca[1.18 g·LCa（NO）·4HO]，每個處理3次重復(fù)，每個重復(fù)4株植物。水培方法參考HOAGLAND等配方并略作修改：0.51 g·LKNO，0.49 g·LMgSO·7HO，0.14 g·LKHPO，1.78 mg·LMnCl·4HO，0.07 mg·LCuSO·5HO，0.23 mg·LZnSO·7HO，0.02 mg·LNaMoO·2HO，9.18 mg·LFe-EDTA，1.54 mg·LHBO，所有納米鈣處理的營養(yǎng)液中加入NaNO以保持NO濃度一致。分別用1/4和1/2全營養(yǎng)液培養(yǎng)3 d后，再用全量營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每隔3 d換一次營養(yǎng)液，全量營養(yǎng)液培養(yǎng)4周，植株出現(xiàn)明顯差異，進(jìn)行收獲及相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 植物生長指標(biāo)的測定

收獲時，各處理隨機選取3株植物，用直尺測量植株株高和根長。用超純水沖洗干凈后，將植株分為地上部和地下部，稱其鮮質(zhì)量。將植株地上部和地下部放入55℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱其干質(zhì)量。用Epson Perfection V700型根系分析儀掃描根系，利用WinRHIZO系統(tǒng)進(jìn)行分析，得到總根長（Total root length，TRL），根表面積（Total surface area，TSA），根體積（Total volume，TV），根平均直徑（Average diameter，AD），根尖數(shù)（Apical number，AN）等指標(biāo)。

1.3.2 植株Ca含量的測定

用干灰化-原子吸收分光光度法測定油菜根、葉片的Ca含量。即稱取0.2 g干燥樣品于研缽中充分研磨，電爐碳化后轉(zhuǎn)入馬弗爐500℃干灰化4 h，冷卻后，加入10 mL 0.1 mol·L的HCl浸提30～60 min，溶解后過濾用原子吸收光譜儀（AAS，AGILENT 204DUO）測定植物中Ca含量。

1.3.3 葉綠素含量及葉片光合參數(shù)（氣體交換參數(shù)）

將新鮮葉片（0.2 g）剪碎后，放入裝有25 mL 95%乙醇的比色管（50 mL）中，遮光放置24 h，然后以95%乙醇為空白，分別在665、649、470 nm處測量其吸光度。葉綠素a（）、葉綠素b（）和類胡蘿卜素（）含量（mg·L）按下式計算：

在收獲當(dāng)日9：00—11：00，使用便攜式光合測定系統(tǒng)（CIRAS-3，USA）測定油菜倒四葉的凈光合速率（A）、蒸騰速率（E）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO濃度（Ci）和水分利用率（WUE）。測定時，葉室流速設(shè)置為300 mL·min，光強設(shè)置為1 200μmol·m·s。

1.3.4 丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量測定

新鮮根樣品0.5 g用5 mL pH為7.8的50 mmol·L磷酸緩沖液（PBS）在低溫條件下研磨，然后在4℃且轉(zhuǎn)速為10 000×條件下離心20 min，過濾后取上清液作為提取物。MDA含量用分光光度計（UV-1800，MAPADA）測量后計算得出?？扇苄缘鞍子每捡R斯亮藍(lán)G250染色法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 26.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析（ANOVA）。采用Duncan多重比較試驗法進(jìn)行差異顯著性檢驗。用Origin 2020制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對油菜生長的影響

不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜生長的影響如圖1所示。結(jié)果表明，較低濃度的Ca（L-asp）-NPs對油菜的生長影響差異不顯著，但是Ca（L-asp）-NPs濃度的升高會促進(jìn)油菜生長。與NPS-0處理相比，25、50、75 mg·LCa（L-asp）-NPs處理對油菜生長無顯著促進(jìn)作用，100 mg·L的Ca（L-asp）-NPs和1.18 g·LCa顯著促進(jìn)了油菜的生長，其根長分別增加16.74%和7.88%，株高分別增加15.74%和17.43%，但是這兩個處理之間油菜長勢無明顯差異。

圖1 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜幼苗生長狀況的影響Figure 1 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on rape seedlings growth

2.2 不同處理對油菜植株生物量的影響

隨著施用Ca（L-asp）-NPs濃度的不同，油菜植株地下部和地上部的質(zhì)量存在顯著性差異（表1）。NPS-0處理的油菜地下部鮮質(zhì)量（RFW）、地上部鮮質(zhì)量（SFW）、總鮮質(zhì)量（TFW）和地下部干質(zhì)量（RDW）是最低的，隨著Ca（L-asp）-NPs濃度的增加，上述指標(biāo)呈現(xiàn)增加趨勢。與NPS-0相比，NPS-100處理油菜的RFW、SFW、TFW和RDW分別增加了116.05%、31.03%、43.37%和140.00%，Ca處理上述指標(biāo)分別增加了88.89%、37.32%、44.62%和80.00%；施用100 mg·LCa（L-asp）-NPs的各指標(biāo)與施用1.18 g·LCa（NO）·4HO無明顯差異。不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜SDW和TDW無顯著影響。缺鈣條件下，植株的根冠比降低，但是施用不同濃度的Ca（L-asp）-NPs對油菜的根冠比影響不顯著。

表1 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜幼苗生物量的影響Table 1 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on seedlings biomass of rape

2.3 不同處理對油菜根系形態(tài)指標(biāo)的影響

總根長（TRL）、總表面積（TRA）、平均直徑（AD）、根系總體積（RV）和根尖數(shù)（AN）可以反映根系生長狀況。結(jié)果表明（表2），不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜根系形態(tài)影響不同，TRL、TSA和AN隨著濃度的增加而增加，AD隨著濃度的增加而減少，RV則在25 mg·LCa（L-asp）-NPs處理時達(dá)到最大值，之后隨著濃度的增加而降低。與NPS-0處理相比，NPS-25和NPS-50對植株的TRL、TSA、RV和AD無顯著影響，NPS-100處 理 的 油 菜TRL、TSA和AN分 別 增 加 了76.08%、30.78%和1 107.31%，AD和RV降 低 了25.79%和2.83%；1.18 g·LCa處理的油菜TRL、TSA和AN最大，AD和RV最小。

表2 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜幼苗根系形態(tài)指標(biāo)的影響Table 2 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on the root morphological characteristics of rape seedlings

2.4 不同處理對油菜根系和葉片中Ca含量的影響

如圖2所示，不同濃度Ca（L-asp）-NPs均顯著增加根系和葉片中的Ca含量，與不施鈣相比，25、50、75 mg·LCa（L-asp）-NPs的油菜根系和葉片中的Ca含量分別增加了35.84%、76.77%、31.92%和92.97%、64.95%、77.47%，其最大值出現(xiàn)在100 mg·LCa（Lasp）-NPs處理，分別增加了59.48%和126.12%，但100 mg·LCa（L-asp）-NPs處理的植株Ca含量顯著低于Ca處理，根系和葉片分別降低了55.72%和36.74%。

圖2 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜幼苗根系和葉片中Ca含量的影響Figure 2 Effects of different concentrations of Ca（L-asp）-NPs on Ca contents in roots and leaves of rape seedlings

2.5 不同處理對油菜葉綠素的影響

如圖3所示，油菜葉片葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量和SPAD值隨著施用Ca（L-asp）-NPs濃度的增加而增加，較低濃度的Ca（L-asp）-NPs對葉片、、和SPAD值無顯著影響，當(dāng)施用量超過75 mg·L時，、、顯著上升，100 mg·LCa（L-asp）-NPs處理的植株葉片葉綠素含量最高。

圖3 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜葉綠素含量的影響Figure 3 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on chlorophyll contents in leaves of rape seedlings

2.6 不同處理對油菜光合參數(shù)的影響

對不同濃度Ca（L-asp）-NPs的油菜葉片光合參數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果表明（表3），施用Ca（L-asp）-NPs和Ca顯著增加了油菜的凈光合速率（A）、胞間CO濃度（Ci）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（E），降低了飽和水汽壓（VPD）。其中，25、50、75 mg·LCa（L-asp）-NPs處理的植株A、Ci、Gs、E、VPD和WUE差異不顯著。與NPS-0處理相比，100 mg·LCa（L-asp）-NPs處理 的 植 株A、Ci、Gs、E顯 著 增 加，分 別 增 加 了295.31%、31.90%、1 158.03%、376.74%，VPD顯著降低48.65%；Ca處理的植株上述指標(biāo)分別顯著增加了367.19%、35.92%、2417.62%、464.29%；VPD顯著降低了59.32%。

表3 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜光合參數(shù)的影響Table 3 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on light parameters of rape seedlings

2.7 不同處理對油菜MDA和可溶性蛋白含量的影響

如圖4A所示，施用Ca（L-asp）-NPs后，油菜根系的MDA含量增加，而葉片中MDA含量下降。不同濃度Ca（L-asp）-NPs處理的根系MDA含量低于Ca處理，而葉片中MDA含量高于Ca處理。與NPS-0處理相比，100 mg·LCa（L-asp）-NPs處理的油菜葉片MDA含量降低了54.82%，根系MDA含量無顯著差異，Ca處理的油菜葉片MDA含量降低了60.05%，根系MDA含量增加了237.80%。

對不同濃度Ca（L-asp）-NPs處理的油菜植株可溶性蛋白含量進(jìn)行分析（圖4B），結(jié)果顯示，施用Ca（L-asp）-NPs增加了油菜根系和葉片的可溶性蛋白含量，與NPS-0處理相比，在100 mg·LCa（L-asp）-NPs處理的條件下，根系和葉片中可溶性蛋白分別增加了115.39%和62.61%，而在Ca處理條件下分別增加了82.92%和94.46%。

圖4 不同濃度Ca（L-asp）-NPs對油菜MDA和可溶性蛋白含量的影響Figure 4 Effects of different concentrations of Ca（L-Asp）-NPs on MDA and soluble protein content of rape seedlings

3 討論

3.1 不同濃度外源Ca（L-asp）-NPs對油菜生長的影響

納米粒子通過根系吸收進(jìn)入植物體內(nèi)，能促進(jìn)或抑制植物的生長發(fā)育，且納米粒子對植物的影響與其濃度密切相關(guān)。本研究表明，施用較低濃度（25、50 mg·L）的Ca（L-asp）-NPs不會顯著促進(jìn)油菜的生長，而隨著濃度的升高，植株株高和根長增加，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg·L時，油菜的株高和根長顯著增加，促進(jìn)植株生物量增加，說明施用100 mg·LCa（L-asp）-NPs可以顯著促進(jìn)油菜的生長。TRL、TSA、AD、RV和AN是衡量根系生長的重要指標(biāo)。近期研究發(fā)現(xiàn)，施用不同濃度Ca（L-asp）-NPs會抑制棉花根系生長，顯著降低其TRL、TSA和RV等根系形態(tài)指標(biāo)，但低濃度（10、80 mg·L）的Ca（L-asp）-NPs會促進(jìn)枳殼根系的生長，高濃度（160、320 mg·L）對枳殼幼苗根系產(chǎn)生毒害效應(yīng)。而本研究發(fā)現(xiàn)，油菜根系生長隨著Ca（L-asp）-NPs濃度的增加，TRL、TSA、AD和AN逐漸上升，說明納米材料對植物根系的影響與植物種類及處理濃度有關(guān)。根系是植物進(jìn)行養(yǎng)分吸收的重要器官，其生長情況直接決定植物吸收養(yǎng)分的能力。本研究中，植株根系和葉片中的鈣含量隨Ca（L-asp）-NPs濃度的升高而升高，說明根系的良

好生長會促進(jìn)植物對鈣元素的吸收與轉(zhuǎn)運；然而Ca（L-asp）-NPs處理的植株根系和葉片的鈣含量顯著低于Ca處理，原因可能是納米顆粒小粒徑的團(tuán)聚效果，使其不易穿過細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使得根系吸收的鈣減少，通過韌皮部或木質(zhì)部向上運輸?shù)拟}減少，導(dǎo)致葉片中鈣減少。

3.2 不同濃度外源Ca（L-asp）-NPs對油菜葉片光合特性的影響

光合作用是植物代謝過程的基礎(chǔ)，納米材料可以改變植物葉片的氣孔開放程度、CO消耗狀況、蒸騰速率及葉綠素含量，進(jìn)而對植物的光合作用產(chǎn)生影響。本研究顯示，施用Ca（L-asp）-NPs顯著增加油菜葉片的Chl a和Chl b含量，進(jìn)而提高葉片對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，激活葉綠體光化學(xué)反應(yīng)；這與GOPINATH等和CAMBROLLE等的 研 究 結(jié) 果 一致，說明Ca（L-asp）-NPs促進(jìn)油菜幼苗的生長機制可能是其提高了植株葉綠素含量和光合作用。在本研究中，Ca（L-asp）-NPs的施用提高油菜葉片光合參數(shù)，其中100 mg·LCa（L-asp）-NPs對葉片光合作用的效果最佳。葉綠素含量和氣孔導(dǎo)度是影響葉片光合效率的主要因素。Ca（L-asp）-NPs的施用增加了油菜葉片葉綠素含量，進(jìn)而提高了光合速率；另外，鈣是植物體內(nèi)的信號分子，作為第二信使參與植物光合作用光合磷酸化和電子傳遞等重要的生理生化過程，促進(jìn)葉片對于光能的吸收利用。且Ca（L-asp）-NPs可能參與植物體內(nèi)碳氮代謝，進(jìn)而提高光合作用，促進(jìn)植株生長。

3.3 不同濃度外源Ca（L-asp）-NPs對油菜抗逆性指標(biāo)的影響

納米材料會對植物體內(nèi)的抗逆指標(biāo)產(chǎn)生不同程度的影響。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物之一，其含量表示脂質(zhì)過氧化程度。本研究表明，施用不同濃度Ca（L-asp）-NPs可以提高油菜根系MDA含量，但Ca（L-asp）-NPs處理的植株根系MDA含量顯著低于Ca處理，這可能是由于納米顆粒聚集在細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上，進(jìn)而對根系膜脂產(chǎn)生不利影響。油菜葉片中MDA含量隨著施用濃度的增加而下降，這是因為隨著Ca（L-asp）-NPs濃度的增加，葉片葉綠素含量增加，光合作用增強，促進(jìn)葉片的生長，保護(hù)細(xì)胞免受過氧化損傷?？扇苄缘鞍鬃鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透勢的平衡，提高細(xì)胞膜的穩(wěn)定性。植株體內(nèi)可溶性蛋白含量隨著Ca（L-asp）-NPs濃度的增加呈現(xiàn)上升的趨勢，說明施用外源Ca（L-asp）-NPs促進(jìn)植物體內(nèi)可溶性蛋白含量的增加，為植物生長提供能量和碳骨架，提高植物的抗逆能力[52]。

4 結(jié)論

（1）外源L-天冬氨酸納米鈣[Ca（L-asp）-NPs]可以促進(jìn)植株根系生長，提高植株葉片葉綠素含量和光合速率，降低葉片丙二醛含量，增加植株體內(nèi)可溶性蛋白的積累，有利于植株生長。

（2）100 mg·L的Ca（L-asp）-NPs對植物生長促進(jìn)效果最佳，植株生長情況與1.18 g·LCa（NO）·4HO處理相比無顯著差異，但其用量大約是鈣離子用量的1/12。因此Ca（L-asp）-NPs可以作為一種納米肥料為油菜生長補充鈣元素。