三鏈核酸在食品安全檢測(cè)中的研究進(jìn)展

孫海燕 雷艷麗 諶委菊 全 珂

(1. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；2. 長(zhǎng)沙理工大學(xué)細(xì)胞化學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410114)

隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和生活水平的提高，近年來(lái)對(duì)食品安全的關(guān)注度也得到了極大提升。影響食品安全的因素主要包括非法成分添加、真菌毒素污染、食源性致病菌污染、農(nóng)獸藥殘留、重金屬污染等[1-3]。這些食源性有害物質(zhì)的攝取對(duì)人體健康造成了一定威脅，輕則腹瀉，重則死亡[4]。因此，建立食品中痕量有害物的分析檢測(cè)技術(shù)對(duì)于評(píng)估食物產(chǎn)業(yè)鏈中各階段潛在有害因素、減少被污染食物的市場(chǎng)流通十分必要。傳統(tǒng)的食源性有害物檢測(cè)方法主要包括色譜分析法[5-6]、質(zhì)譜法[7-8]、化學(xué)免疫分析法[9-10]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)[11-13]等，上述方法雖然準(zhǔn)確性高，但是前處理復(fù)雜、對(duì)操作者專業(yè)素養(yǎng)要求高，抑或涉及大型儀器設(shè)備，不適用于食品的日常、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。因此，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速、可推廣的食品有害物檢測(cè)新方法是近年來(lái)食品安全領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。

三鏈核酸(triplex nucleic acid, TNA)是在Watson-Crick雙鏈核酸基礎(chǔ)上，由第3條寡核苷酸鏈以Hoogsteen氫鍵嵌入到雙鏈大溝中形成的三螺旋核酸結(jié)構(gòu)。三鏈核酸結(jié)構(gòu)具有柔軟、可設(shè)計(jì)性強(qiáng)的特點(diǎn)，因此可對(duì)其環(huán)部或莖部進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，使三鏈核酸能夠響應(yīng)特定刺激物或靶標(biāo)發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)功能活化[14]。此外，區(qū)別于其他功能核酸，三鏈核酸可實(shí)現(xiàn)信號(hào)識(shí)別單元和信號(hào)輸出單元的分離，在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)，易與多種信號(hào)輸出模式結(jié)合，如熒光、比色、電化學(xué)、拉曼等，便于根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求開(kāi)發(fā)適宜傳感平臺(tái)[15-16]。研究擬綜述三鏈核酸的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)，以及基于三鏈核酸構(gòu)建的熒光傳感器、電化學(xué)傳感器、比色傳感器、其他小眾傳感器在食品安全分析領(lǐng)域的應(yīng)用，并對(duì)三鏈核酸在食品安全快速分析檢測(cè)中的發(fā)展前景與挑戰(zhàn)進(jìn)行展望，以期為食品有害物的快速檢測(cè)提供新思路。

1 三鏈核酸的結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性

1.1 三鏈核酸結(jié)構(gòu)

在核酸雙螺旋結(jié)構(gòu)中，處于兩條鏈之間的堿基對(duì)并不在核酸鏈的軸上，因此造成雙鏈結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱性，形成大溝和小溝。其中，大溝中存在多余的氫鍵給體和受體，為第3條核酸鏈附著進(jìn)而形成三鏈復(fù)合體提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。就具體結(jié)合方式而言，第3條核酸鏈既能以平行方式，也能以反平行的方式與雙鏈核酸纏繞在一起，如圖1(a)所示[17]。通常，富含嘧啶的單鏈DNA以平行的方式與雙鏈DNA中富含嘌呤的鏈經(jīng)Hoogsteen鍵結(jié)合，而富含嘌呤的單鏈DNA則以反平行的方式與雙鏈DNA

圖1 三鏈核酸結(jié)構(gòu)Figure 1 Different triplex structures

中富含嘌呤的鏈經(jīng)反Hoogsteen鍵結(jié)合。與雙鏈核酸類似，三鏈核酸的形成建立在堿基特異性鍵合基礎(chǔ)上，主要分為C·G-C、G·G-C、T·A-T的平行三重結(jié)構(gòu)以及C·G-C、G·G-C、T·A-T、A·A-T的反平行三重結(jié)構(gòu)[圖1(a)]。根據(jù)第3條鏈的來(lái)源，三鏈核酸可分為分子內(nèi)三螺旋結(jié)構(gòu)和分子間三螺旋結(jié)構(gòu)[圖1(b)]。前者是由一條單鏈寡核苷酸通過(guò)自身折疊纏繞形成的三螺旋結(jié)構(gòu)，其堿基序列具有一定鏡像重復(fù)性。后者又可分為兩種形式：① 單鏈核酸與雙鏈核酸經(jīng)Hoogsteen或反Hoogsteen鍵形成的三螺旋結(jié)構(gòu)；② 一條單鏈核酸與另一單鏈核酸經(jīng)Watson-Crick和Hoogsteen雙重作用形成的鉗夾式三螺旋結(jié)構(gòu)。

1.2 影響三鏈核酸穩(wěn)定性的因素

目前，已有一系列以三螺旋結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的三鏈核酸分子探針被開(kāi)發(fā)用于生化傳感分析，而其實(shí)現(xiàn)功能的基本前提是三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定形成。影響三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素可分為內(nèi)因和外因兩個(gè)方面，其中內(nèi)因主要來(lái)源核酸序列本身，包括三螺旋區(qū)域的鏈長(zhǎng)度[18]、堿基組成[19]、骨架本性[20]等因素。外因則指外界環(huán)境對(duì)三螺旋結(jié)構(gòu)形成的影響，主要涉及溶液中陽(yáng)離子濃度[21]、pH[22]、溫度[23]等因素。上述因素往往通過(guò)影響第3條核酸鏈與核酸雙鏈結(jié)合時(shí)的氫鍵作用強(qiáng)度或雙鏈核酸重排時(shí)的能量大小，來(lái)影響三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[24]。

1.2.1 鏈長(zhǎng)度的影響 參與三螺旋結(jié)構(gòu)形成的寡聚脫氧核苷酸(ODN)長(zhǎng)度是影響其穩(wěn)定性的重要因素。一般來(lái)說(shuō)，鏈長(zhǎng)度太短，Hoogsteen氫鍵作用力太弱，不易形成穩(wěn)定的三螺旋結(jié)構(gòu)。鏈長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，則會(huì)發(fā)生自折疊形成穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，不利于三螺旋結(jié)構(gòu)的形成。研究[25]表明，在分子間嘌呤嘌呤嘧啶三螺旋DNA的形成中，最佳鏈長(zhǎng)度為12個(gè)堿基。Brown等[26]發(fā)現(xiàn)，在RNA·DNA-DNA型三螺旋結(jié)構(gòu)形成中，第3條RNA鏈長(zhǎng)度不得少于19個(gè)核苷酸，但將其長(zhǎng)度延長(zhǎng)至27個(gè)核苷酸并不會(huì)提高三鏈的穩(wěn)定性。此外，F(xiàn)rancesco等[27]發(fā)現(xiàn)鉗形三鏈環(huán)部長(zhǎng)度亦會(huì)影響其穩(wěn)定性。環(huán)部長(zhǎng)度縮短，一方面可以降低三鏈形成所需熵變，進(jìn)而有利于三鏈的形成，使其穩(wěn)定區(qū)間向堿性pH移動(dòng)；另一方面，其可提高三鏈結(jié)構(gòu)的解鏈溫度(Tm)，改善熱穩(wěn)定性。

1.2.2 堿基組成的影響 三螺旋結(jié)構(gòu)的形成嚴(yán)格遵循堿基配對(duì)原則。堿基錯(cuò)配、缺失均會(huì)導(dǎo)致第3條鏈扭曲，顯著降低三鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[28]。Pan等[29]發(fā)現(xiàn)，三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的破壞程度與具體的錯(cuò)配位置有關(guān)。一般而言，由于中間位置的錯(cuò)配能夠干擾相鄰位置堿基的相互作用，因此中間錯(cuò)配比末端錯(cuò)配更容易破壞三螺旋結(jié)構(gòu)。此外，三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與T·A-T/C·G-C三聯(lián)體的相對(duì)含量密切相關(guān)[30]。當(dāng)T·A-T含量由50%提升至100%時(shí)，三鏈穩(wěn)定的pH區(qū)間可向右拓寬4個(gè)單位，表明序列的堿基組成對(duì)三鏈形成的影響不可忽視。

1.2.3 堿基及核酸骨架修飾的影響 甲基化是最常見(jiàn)的堿基修飾方式之一，通常選擇胞嘧啶的5位點(diǎn)修飾。甲基化修飾可增強(qiáng)三鏈核酸的疏水作用力，進(jìn)而拓寬三鏈穩(wěn)定存在的pH區(qū)間，同時(shí)提高其解鏈溫度和親和常數(shù)[31]。然而并不是所有取代基都能增加三鏈的穩(wěn)定性，且相同化學(xué)基團(tuán)在不同位點(diǎn)取代對(duì)三鏈穩(wěn)定性的影響也不盡相同。若在胞嘧啶的5位點(diǎn)采用丙基或溴取代會(huì)降低三鏈的穩(wěn)定性，但若在尿嘧啶的5位點(diǎn)取代，則有利于三鏈的形成[32]。這可能與取代后成鍵原子的電荷密度變化有關(guān)。此外，核酸骨架特性也與三螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)。研究[33]表明，以多肽骨架取代磷酸二酯骨架所得到的肽核酸與DNA形成三鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性得到明顯改善有關(guān)。

1.2.4 pH和溫度的影響 通常，第3條鏈中胞嘧啶(C)的N3位點(diǎn)發(fā)生質(zhì)子化后才可與雙螺旋中鳥(niǎo)嘌呤(G)形成Hoogsteen氫鍵。因此，C·G-C含量較高的三螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境pH更敏感，且C·G-C含量越高，相應(yīng)三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定存在的pH值越低。與之相比，T·A-T堿基對(duì)的形成不涉及堿基的質(zhì)子化，因而富含T·A-T的三螺旋結(jié)構(gòu)能在中性甚至堿性環(huán)境中穩(wěn)定存在。Liu等[34]發(fā)現(xiàn)，隨著pH的降低，含有60% C·G-C的三鏈核酸形成率逐漸升高，而含100% T·A-T的三鏈核酸形成率并未發(fā)生改變。此外，對(duì)胞嘧啶的C5位點(diǎn)進(jìn)行甲基化修飾或引入嵌入劑噻唑橙(TO)，均可提高C·G-C型DNA三鏈在中性或更高pH下的穩(wěn)定性[35]。而增加三螺旋結(jié)構(gòu)中T·A-T/C·G-C的比例亦可緩解pH對(duì)三鏈穩(wěn)定性的影響[30]。

與雙鏈核酸類似，三鏈核酸也存在Tm值。當(dāng)環(huán)境溫度大于三鏈核酸的Tm時(shí)，三螺旋結(jié)構(gòu)將被破壞，增加三螺旋結(jié)構(gòu)中C·G-C含量可以提高其Tm。

1.2.5 陽(yáng)離子濃度的影響 影響三螺旋結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的鹽離子主要是帶正電的陽(yáng)離子，是因?yàn)殛?yáng)離子可以屏蔽核酸骨架的負(fù)電荷，進(jìn)而降低核酸鏈之間的排斥力；同時(shí)，陽(yáng)離子骨架的脫水作用有利于三鏈核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[36]。Thomas等[37]發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)離子類型及離子強(qiáng)度均對(duì)三鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有影響，金屬離子對(duì)三鏈穩(wěn)定性的改善作用由大到小依次為Mg2+>Ca2 +>Sr2 +>Ba2+>Na+。此外，三螺旋結(jié)構(gòu)的Tm隨二價(jià)陽(yáng)離子濃度的增加而增加。當(dāng)離子濃度相同時(shí)，溶液中陽(yáng)離子價(jià)態(tài)越高，所形成的三鏈結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。在含多種不同陽(yáng)離子的溶液中，還存在離子競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用。如濃度過(guò)高的Na+可與Mg2+競(jìng)爭(zhēng)核酸上的鹽離子位點(diǎn)，從而降低三鏈核酸的穩(wěn)定性[38-39]。

2 基于三鏈核酸的分析傳感方法

2.1 熒光分析法

熒光分析法具有靈敏度高、需樣量少、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，在痕量食源性有害物的檢測(cè)中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。基于三鏈核酸的熒光分析法基本原理為：利用靶標(biāo)誘導(dǎo)三鏈核酸形成或解體，產(chǎn)生熒光變化，從而將生物識(shí)別事件轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào)?；谌満怂岬膫鞲胁呗源篌w分為兩類：傳感探針與靶標(biāo)作用后，熒光產(chǎn)生或增強(qiáng)(“off-on”策略)；傳感探針與靶標(biāo)作用后，熒光降低或熄滅(“on-off”策略)。在一定濃度范圍內(nèi)，傳感探針強(qiáng)度變化與靶標(biāo)濃度呈正比。因此，可以根據(jù)熒光變化與否判定靶標(biāo)是否存在，根據(jù)熒光強(qiáng)度變化程度確定靶標(biāo)濃度。相比于“off-on”策略，“on-off”的熒光檢測(cè)策略易受非靶物質(zhì)干擾，產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)，且難以確定檢測(cè)上限，應(yīng)用的廣泛程度不如前者。

食品中農(nóng)、獸藥殘留超標(biāo)會(huì)對(duì)人們的生命健康造成危害。如抗生素常被添加于飼料中用以避免養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)生細(xì)菌性傳染疾病，其經(jīng)食物鏈在人體中富集后，可引起人體內(nèi)菌群紊亂及抗生素耐藥等不良影響[40]。Wen等[41]結(jié)合三鏈核酸和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)發(fā)展了一種“on-off”型熒光檢測(cè)平臺(tái)用于牛奶中氯霉素的放大檢測(cè)。該工作利用氯霉素觸發(fā)HCR反應(yīng)，形成修飾有多個(gè)熒光受體的DNA雙鏈。所得DNA雙鏈又可與熒光供體標(biāo)記的第3條鏈特異性作用形成三鏈復(fù)合體，將熒光受體和供體拉近，導(dǎo)致二者發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，供體熒光降低。該方法具有良好的檢測(cè)靈敏性，檢測(cè)限為1.2 pg/mL，檢測(cè)加標(biāo)牛奶樣品的平均回收率為97.5%～106.0%。Deng等[42]構(gòu)建了一種基于雙重三螺旋結(jié)構(gòu)的“off-on”型熒光探針用于氯霉素的檢測(cè)[圖2(a)]。利用三鏈核酸環(huán)部核酸適配體序列在識(shí)別氯霉素后發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致三鏈結(jié)構(gòu)被破壞，熒光基元和淬滅基團(tuán)遠(yuǎn)離，從而實(shí)現(xiàn)熒光恢復(fù)。該設(shè)計(jì)中，由于一個(gè)熒光基團(tuán)可同時(shí)被兩個(gè)淬滅基團(tuán)熄滅熒光，因此在背景信號(hào)和檢測(cè)信噪比方面，此探針較傳統(tǒng)的1∶1熄滅型探針更具優(yōu)勢(shì)，檢測(cè)限低至0.18 nmol/L，并能精確測(cè)定魚(yú)和牛奶加標(biāo)樣品中氯霉素含量。在農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面，Qu等[43]結(jié)合三鏈核酸和G-四聚體，開(kāi)發(fā)了一種免標(biāo)的熒光分子開(kāi)關(guān)用于啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)。該分子開(kāi)關(guān)的環(huán)部設(shè)計(jì)為啶蟲(chóng)脒的核酸適配體序列，作為信號(hào)識(shí)別單元，其在識(shí)別啶蟲(chóng)脒后導(dǎo)致三鏈解體，釋放出中間信號(hào)鏈。后者可形成G-四聚體，結(jié)合并增強(qiáng)N-甲基卟啉二丙酸 IX(NMM)熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)啶蟲(chóng)脒的檢測(cè)，檢測(cè)限為2.38 nmol/L。

圖2 基于三鏈核酸的熒光分析方法用于食品有害物的檢測(cè)研究Figure 2 Application of fluorescence analysis method based on triplex nucleic acid in the detection of food pests

此外，基于三鏈核酸的熒光傳感方法在食品中重金屬離子、非法添加劑的檢測(cè)也相繼被報(bào)道[44-45]。Liu等[46]利用T-Hg2+-T堿基配對(duì)作用穩(wěn)定核酸發(fā)卡結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上引入外切酶輔助放大技術(shù)和三鏈核酸開(kāi)關(guān)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg離子的高靈敏熒光檢測(cè)，檢測(cè)限為1.04 pmol/L，檢測(cè)線性范圍為0.01～50.00 nmol/L[圖2(b)]。Yuan等[47]設(shè)計(jì)了一種T-三聚氰胺-T堿基錯(cuò)配介導(dǎo)的滾環(huán)信號(hào)放大(RCA)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛奶中三聚氰胺的熒光檢測(cè)，檢測(cè)限為2.5 nmol/L。將熒光分析法與核酸放大技術(shù)聯(lián)用，可極大改善探針檢測(cè)靈敏度，為痕量食源性有害物的檢測(cè)提供了重要技術(shù)支撐。然而，熒光信號(hào)易受復(fù)雜基質(zhì)影響，開(kāi)發(fā)新型熒光基團(tuán)或熒光產(chǎn)生模式以滿足在復(fù)雜體系中的檢測(cè)需求將是未來(lái)的發(fā)展方向。

2.2 電化學(xué)分析法

電化學(xué)分析方法具有靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)單、設(shè)備易微型化等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于食品的現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)。電化學(xué)生物傳感器的基本原理是以酶、抗體、核酸等生物材料作為識(shí)別元件，利用固體電極將識(shí)別元件與靶標(biāo)之間的特異性相互作用轉(zhuǎn)換為電化學(xué)信號(hào)(如電勢(shì)、電阻、電容或電流等)，根據(jù)輸出信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)定量或定性分析。在基于三鏈核酸的電化學(xué)分析法中，三鏈核酸通常被固定于電極上，用于捕獲電活性分子。

食源性致病菌及生物毒素污染是引起食源性疾病和食物中毒的主要原因，對(duì)人體健康造成了不良影響，輕度導(dǎo)致腸胃炎，重則引起器官功能障礙[48]。食源性致病菌和毒素的快速、靈敏檢測(cè)是當(dāng)前食品安全領(lǐng)域的重要挑戰(zhàn)。Zhou等[49]發(fā)展了一種基于三鏈核酸分子開(kāi)關(guān)的電化學(xué)傳感器用于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)[圖3(a)]。通過(guò)利用核酸適配體—磁珠系統(tǒng)特異性識(shí)別金黃色葡萄球菌，進(jìn)而釋放并分離封閉DNA鏈。后者參與酶輔助的鏈置換反應(yīng)，產(chǎn)生大量信號(hào)DNA鏈，將生物識(shí)別事件放大。信號(hào)DNA能夠特異性結(jié)合并破壞固定于電極表面的三鏈分子開(kāi)關(guān)，暴露出位于三鏈莖部的富G序列。富G序列折疊形成G-四聚體后將捕獲電活性分子hemin，使得電流信號(hào)發(fā)生變化。相較于無(wú)信號(hào)放大過(guò)程的傳感策略，該方法的靈敏度得到顯著改善，檢測(cè)限低至8 CFU/mL，能準(zhǔn)確檢測(cè)加標(biāo)蜂蜜樣品中的金黃色葡萄球菌。Jie等[50]將用于捕獲hemin的三鏈核酸分子修飾于電極上，并在體系中引入聚合酶和外切酶輔助的雙重信號(hào)放大反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)毒素脂多糖的超靈敏電化學(xué)檢測(cè)，檢測(cè)限可達(dá)0.012 fg/mL。

三聚氰胺是一種非法食品添加劑，常被不法商家添加至奶粉及動(dòng)物飼料中。Liu等[51]利用堿性位點(diǎn)(AP)對(duì)三聚氰胺的高親和性，構(gòu)建了三聚氰胺穩(wěn)定的鉗形三鏈結(jié)構(gòu)，通過(guò)核酸外切酶III切割鉗形三鏈結(jié)構(gòu)，生成亞甲基藍(lán)標(biāo)記的核酸短鏈，后者擴(kuò)散到電極表面，產(chǎn)生亞甲基電信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的靈敏檢測(cè)[圖3(b)]。根據(jù)輸出的電化學(xué)信號(hào)強(qiáng)度可確定三聚氰胺含量，檢測(cè)線性范圍為50 nmol/L～500 μmol/L，檢測(cè)限為8.7 nmol/L，顯著低于傳統(tǒng)的ELISA分析方法。

圖3 基于三鏈核酸的電化學(xué)分析方法用于食品有害物的檢測(cè)研究Figure 3 Electrochemical analysis method based on triplex nucleic acid for the detection of food pests

總體而言，當(dāng)前基于三鏈核酸的電化學(xué)分析方法在檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)成本方面具有優(yōu)勢(shì)，但是在快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面略顯不足。加速推進(jìn)三鏈核酸探針與微型化電化學(xué)信號(hào)發(fā)生器(如血糖儀)聯(lián)用將是該領(lǐng)域的現(xiàn)實(shí)需求。

2.3 比色分析法

與熒光分析法和電化學(xué)分析法相比，比色分析法在檢測(cè)靈敏度方面略顯不足，但是其檢測(cè)結(jié)果更加直觀、可肉眼觀測(cè)，非常適用于食品污染物的快速、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。在基于三鏈核酸的比色傳感平臺(tái)中，三鏈核酸通常用來(lái)固定或封閉具備催化顯色反應(yīng)能力的酶(包括蛋白酶、核酸酶、納米酶)。

真菌毒素容易在食品加工、貯藏等環(huán)節(jié)進(jìn)入食物鏈，是常見(jiàn)的食品污染物，具有致畸、致癌等副作用，且大部分性質(zhì)穩(wěn)定，難以被破壞，是食品安全檢測(cè)領(lǐng)域關(guān)注的重點(diǎn)[52]。Xu等[53]利用三鏈核酸封閉脫氧核酶活性，開(kāi)發(fā)了一種比色傳感平臺(tái)用于赭曲霉素的快速檢測(cè)(圖4)。將三鏈核酸的環(huán)部設(shè)計(jì)為核酸適配體序列，其結(jié)合赭曲霉素后發(fā)生構(gòu)象變化，導(dǎo)致三鏈解體，核酶鏈被釋放。核酶鏈繼而結(jié)合hemin形成具有催化活性的復(fù)合體，催化H2O2氧化ABTS顯色。檢測(cè)過(guò)程可在22～37 ℃的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行，1 h即可獲得檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)限為10～1 500 μg/kg。Luo等[54]利用脂多糖誘導(dǎo)三鏈解體進(jìn)而觸發(fā)HCR反應(yīng)，在磁珠上形成修飾有多個(gè)辣根過(guò)氧化物酶的DNA長(zhǎng)鏈，磁分離后，利用辣根過(guò)氧化物酶催化TMB顯色。該方法檢測(cè)過(guò)程不超過(guò)4 h，肉眼觀察的檢測(cè)限為20 ng/mL，利用光學(xué)儀器獲得的檢測(cè)限為50 pg/mL。該方法通過(guò)引入HCR核酸放大步驟，在一定程度上彌補(bǔ)了比色法檢測(cè)靈敏度低的不足，為微量或痕量食源性有害物的現(xiàn)場(chǎng)、高靈敏檢測(cè)提供了重要思路。

圖4 基于三鏈DNA的比色傳感平臺(tái)檢測(cè)赭曲霉素原理圖[53]Figure 4 Illustration of triplex DNA-based colorimetric platform for rapid detection of Ochratoxin A

與上述利用酶催化底物顯色的檢測(cè)思路不同，Ling等[55]利用金黃色葡萄球菌核酸序列的PCR產(chǎn)物誘導(dǎo)三鏈核酸形成，進(jìn)而介導(dǎo)金納米顆粒聚集發(fā)生顏色變化，10 min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌的可視化檢測(cè)。根據(jù)紫外吸收測(cè)定的檢測(cè)限為0.28 pg/0.05 mL，檢測(cè)線性范圍為16.0 fg/μL～1.6 ng/μL。但是基于金納米顆粒聚集的比色法易受復(fù)雜基質(zhì)的影響，難以適用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。若能引入磁分離技術(shù)，有望克服上述不足。

2.4 其他分析方法

除上述分析方法外，Xu等[56]建立了一種基于核酸三鏈體系的表面增強(qiáng)拉曼光譜方法用于Ag+的快速檢測(cè)。當(dāng)Ag+存在時(shí)，其可介導(dǎo)C-Ag+-C配位作用，促使核酸三鏈形成，導(dǎo)致修飾有羅丹明6G的金納米顆粒團(tuán)聚，產(chǎn)生羅丹明6G的拉曼信號(hào)峰，從而達(dá)到檢測(cè)Ag+的目的。Ebrahim等[57]針對(duì)多氯聯(lián)苯這種具有持久生物累積毒性的物質(zhì)，開(kāi)發(fā)了一種基于液晶的無(wú)標(biāo)記、快速分析方法(圖5)。該方法利用多氯聯(lián)苯破壞三螺旋結(jié)構(gòu)，釋放中間信號(hào)鏈與固定于玻片上互補(bǔ)序列雜交，進(jìn)而擾亂玻片上物質(zhì)的垂直定向，導(dǎo)致從暗到亮的光信號(hào)變化。該方法的檢測(cè)下限為1.5×10-5μg/L，能選擇性檢測(cè)自來(lái)水、環(huán)境水和牛奶中的多氯聯(lián)苯。目前已有報(bào)道將液晶傳感模式與手機(jī)等便攜設(shè)備整合，因此利用該傳感模式有望在食品有害物的現(xiàn)場(chǎng)、快速檢測(cè)方面取得突破。

圖5 基于三鏈DNA的液晶傳感平臺(tái)檢測(cè)多氯聯(lián)苯的 示意圖[57]Figure 5 The schematic diagram of the triplex DNA-based LC biosensor for PCB77 detection

3 總結(jié)與展望

綜上，三鏈核酸具有易設(shè)計(jì)與修飾、結(jié)構(gòu)可控以及信號(hào)識(shí)別單元與信號(hào)報(bào)告單元分離等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于構(gòu)建生物傳感器，目前已在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中開(kāi)展應(yīng)用研究。在生化分析應(yīng)用中，基于材料的同質(zhì)性，常將核酸適配體、G-四連體等功能核酸與三鏈核酸整合為一體，前者可賦予三鏈核酸以高靶標(biāo)選擇性，后者一般設(shè)計(jì)成三螺旋結(jié)構(gòu)中的中間鏈，作為三鏈核酸的信號(hào)輸出單元。

此外，三鏈核酸還能夠與催化發(fā)卡自組裝(HCR)、鏈置換(CHA)等核酸放大方法結(jié)合，提高對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)靈敏度。

雖然基于三鏈核酸的傳感平臺(tái)在食源性有害物的檢測(cè)中已取得一些進(jìn)展，但結(jié)合當(dāng)前研究開(kāi)發(fā)現(xiàn)狀和未來(lái)實(shí)際應(yīng)用需求，該傳感平臺(tái)在以下3個(gè)方面有待改善：① 提高三鏈核酸的穩(wěn)定性，使其能夠直接用于復(fù)雜食品基質(zhì)中有害物的檢測(cè)，如此，可避免復(fù)雜的前處理，使真正意義上的快速、臨場(chǎng)檢測(cè)成為可能；② 豐富三鏈核酸的靶識(shí)別模式和機(jī)理，拓展其在食品安全檢測(cè)應(yīng)用中的廣度；③ 加強(qiáng)與紙芯片、微流控、血糖儀、智能手機(jī)等便攜式設(shè)備的聯(lián)用，加速臨場(chǎng)檢測(cè)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)和商業(yè)化。隨著基于三鏈核酸的分析方法在穩(wěn)定性、檢測(cè)機(jī)理、應(yīng)用革新方面的不斷完善，三鏈核酸有望在食品安全即時(shí)、快速檢測(cè)方面發(fā)揮重要作用。