植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖工藝優(yōu)化

李小杰 郭 怡 馬 倩 王 璞 肖 萍,2

(1. 天津農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300392)

南瓜又稱(chēng)番瓜、樓瓜、金冬瓜，為葫蘆科蔓生藤本植物南瓜果實(shí)，原產(chǎn)亞洲南部、非洲和南美洲地區(qū)[1]。南瓜中富含氨基酸、蛋白質(zhì)、纖維素及維生素等多種營(yíng)養(yǎng)成分[2-5]。其中多糖類(lèi)物質(zhì)是具有保健功能的生物活性成分。研究表明，南瓜多糖具有抗氧化[6]、抗腫瘤[7]、降血壓、血糖及血脂作用[8-9]。目前，有關(guān)南瓜多糖的研究主要集中在南瓜多糖的分離提取、生物活性及結(jié)構(gòu)研究等方面，對(duì)其生物轉(zhuǎn)化的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

生物轉(zhuǎn)化[10]是利用植物離體細(xì)胞或器官、動(dòng)物細(xì)胞、微生物及其細(xì)胞器，以及游離酶對(duì)外源性化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價(jià)值產(chǎn)物的生理生化反應(yīng)，其中應(yīng)用最廣泛的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)是利用微生物體系進(jìn)行化合物的結(jié)構(gòu)修飾[11]。乳酸菌是一類(lèi)細(xì)菌的統(tǒng)稱(chēng)，這些細(xì)菌能夠利用碳水化合物生成乳酸[12-13]。植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是乳酸菌的一種，主要用于食品、乳制品、肉類(lèi)和蔬菜的發(fā)酵。Gao等[14]利用從傳統(tǒng)泡菜中分離的植物乳桿菌NCU116對(duì)苦瓜多糖進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，明顯改善了T2DM模型大鼠高血糖、高胰島素、高血脂和氧化應(yīng)激水平，并且提高了腸道菌群中Lactococcuslaudensis和Prevotellaloescheii的豐度，降低了腸道pH值。張志紅[15]通過(guò)植物乳桿菌NCU116發(fā)酵蘆筍漿，探討了發(fā)酵蘆筍多糖和蘆薈多糖的理化性質(zhì)和體內(nèi)體外活性變化，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵蘆筍多糖的抗氧化能力得到了增強(qiáng)，并提高了其免疫活性，小鼠藥物性肝損傷得到了一定修復(fù)。Lee等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化后的鐵釘菜多糖在體外具有更強(qiáng)的DPPH自由基和羥自由基清除能力，在體內(nèi)也可減少由伽瑪射線輻照引起的氧化應(yīng)激斑馬魚(yú)的卵黃囊水腫和尾巴彎曲畸形，提高斑馬魚(yú)的存活率。彭興興等[17]將乳酸菌應(yīng)用到南瓜中制成南瓜乳酸發(fā)酵飲料，并取得了一定研究成果，但大部分研究主要集中于工藝優(yōu)化方面[18]，或者是對(duì)乳酸菌發(fā)酵南瓜風(fēng)味物質(zhì)的研究，而對(duì)乳酸菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖提高其生物活性方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬通過(guò)植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖，并對(duì)其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，旨在為促進(jìn)南瓜資源合理深加工，提高其利用效能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南瓜：市售；

植物乳酸桿菌nbkBC299：諾佰克(武漢)生物科技有限公司；

MRS肉湯培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)：LGR20-W型，北京京立離心機(jī)有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：DLK-5003型，寧波新芝生物科技有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-30R型，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；

電子天平：AX224ZH型，奧豪斯儀器(常州)有限公司；

潔凈工作臺(tái)：SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1200型，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖工藝流程

成熟南瓜→去皮去瓤→打漿→冷凍干燥→南瓜粉→溶解→滅菌(115 ℃、20 min)→冷卻→接種→發(fā)酵→冷凍干燥→發(fā)酵南瓜粉→溶解→多糖提取→濃縮→醇沉→離心→冷凍干燥→南瓜多糖凍干粉

1.3.2 多糖提取率測(cè)定 根據(jù)池源等[19]的方法，并按式(1) 計(jì)算多糖提取率。

(1)

式中：

R1——多糖提取率，%；

c——多糖的質(zhì)量濃度，g/L;

v——多糖液體體積，mL;

n——稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 DPPH自由基(DPPH·)清除率測(cè)定 參照韋獻(xiàn)雅等[20]的方法，并按式(2)計(jì)算DPPH·清除率。

(2)

式中：

R2——自由基清除率，%；

Ai——樣品測(cè)定管的吸光度；

Aj——空白對(duì)照組的吸光度；

A0——樣品對(duì)照組的吸光度。

1.3.4 羥基自由基(OH·)清除率測(cè)定 參照程龍[21]的方法，并按式(2)計(jì)算OH·清除率。

(3)

式中：

Ai——樣品測(cè)定管的吸光度值;

A0——樣品溶劑(蒸餾水)代替樣品測(cè)定的吸光度。

1.3.6 鐵離子還原力測(cè)定 參照雷兵[22]的方法。

1.3.7 植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖單因素試驗(yàn)

(1) 搖床轉(zhuǎn)速：固定料液比1∶20 (g/mL)，接種量1%，溫度37 ℃，考察搖床轉(zhuǎn)速(50，100，150，200 r/min)對(duì)多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

(2) 溫度：固定料液比1∶20 (g/mL)，接種量1%，轉(zhuǎn)速50 r/min，考察溫度(28，32，37，42 ℃)對(duì)多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

(3) 料液比：固定接種量1%，搖床轉(zhuǎn)速50 r/min，溫度37 ℃，考察料液比[m南瓜粉∶V蒸餾水分別為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL)]對(duì)多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

(4) 接種量：固定料液比1∶20 (g/mL)，搖床轉(zhuǎn)速50 r/min，溫度37 ℃，考察接種量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%)對(duì)多糖提取率和DPPH·清除率的影響。

1.3.8 植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇搖床轉(zhuǎn)速、溫度、料液比、接種量4個(gè)因素，利用L9(34)正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖工藝。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以“x±S”表示。利用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖菌種篩選

由圖1可知，生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖對(duì)DPPH·的清除率效果最佳的3組為植物乳桿菌nbkBC299搖床發(fā)酵48 h>植物乳桿菌nbkBC299靜止發(fā)酵48 h>未發(fā)酵南瓜靜止24 h，說(shuō)明通過(guò)植物乳桿菌的生物轉(zhuǎn)化作用可以提高南瓜多糖的體外抗氧化活性。

1. 植物乳桿菌nbkMA2靜止發(fā)酵24 h 2. 植物乳桿菌nbkBC299靜止發(fā)酵24 h 3.未發(fā)酵南瓜靜止24 h 4. 植物乳桿菌nbkMA2靜止發(fā)酵48 h 5. 植物乳桿菌nbkBC299靜止發(fā)酵48 h 6. 未發(fā)酵南瓜靜止48 h 7. 植物乳桿菌nbkMA2搖床發(fā)酵24 h 8. 植物乳桿菌nbkBC299搖床發(fā)酵24 h 9. 未發(fā)酵南瓜搖床24 h 10. 植物乳桿菌nbkMA2搖床發(fā)酵48 h 11. 植物乳桿菌nbkBC299搖床發(fā)酵48 h 12. 未發(fā)酵南瓜搖床48 h 字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖1 植物乳桿菌nbkMA2和nbkBC299轉(zhuǎn)化南瓜多糖對(duì)DPPH·清除率的影響Figure 1 Effects of pumpkin polysaccharides transformed by Lactobacillus plantae nbkMA2 and nbkBC299 on DPPH free radical scavenging rate

2.2 植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖單因素試驗(yàn)

2.2.1 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖的影響

由圖2可知，生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖提取率隨搖床轉(zhuǎn)速的升高逐漸降低，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為50 r/min時(shí)南瓜多糖提取率最高為(55.19±0.32)%，顯著高于搖床轉(zhuǎn)速為100～200 r/min時(shí)的(P<0.05)，主要是由于搖床的機(jī)械撞擊作用導(dǎo)致南瓜細(xì)胞越來(lái)越容易被破壞，多糖暴露于細(xì)胞外，使菌種更好利用多糖，從而分解多糖，故提取率下降[23]。隨著搖床轉(zhuǎn)速的提高，南瓜多糖對(duì)DPPH·的清除率呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min時(shí)，南瓜多糖對(duì)DPPH·清除率最高為(44.40±0.22)%，且顯著高于其他條件下的(P<0.05)，由于轉(zhuǎn)速過(guò)快，多糖暴露于細(xì)胞外而被過(guò)多分解成單分子糖類(lèi)物質(zhì)，可能造成其對(duì)DPPH·清除率的下降。綜上，選取搖床轉(zhuǎn)速50，100，150 r/min進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)南瓜多糖提取率和 DPPH·清除率的影響Figure 2 Effects of shaking speed on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.2 溫度對(duì)植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖的影響 由圖3可知，不同溫度下的生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖提取率無(wú)顯著差異。當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖對(duì)DPPH·清除率最高為(40.37±0.17)%，且顯著高于其他條件下的(P<0.05)，可能是因?yàn)?7～37 ℃溫度較低，對(duì)多糖結(jié)構(gòu)未產(chǎn)生明顯影響，多糖類(lèi)物質(zhì)[24-25]未被破壞，導(dǎo)致其對(duì)DPPH·清除率逐漸升高，隨著溫度的升高，多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的改變而導(dǎo)致活性下降，DPPH·清除率也隨之下降。綜上，選取溫度32，37，42 ℃進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖3 溫度對(duì)南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影響Figure 3 Effects of temperature on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.3 料液比對(duì)植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖的影響

由圖4可知，生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖提取率隨料液比的增大逐漸降低，當(dāng)料液比為1∶10 (g/mL)時(shí)南瓜多糖提取率最高，與料液比為1∶20～1∶40 (g/mL)時(shí)有顯著差異(P<0.05)，可能是由于南瓜細(xì)胞或組織內(nèi)外濃度差隨料液比的增加而減小，不利于南瓜多糖向溶液中擴(kuò)散，因此南瓜多糖提取率逐漸降低[26]，而當(dāng)料液比為1∶20 (g/mL) 時(shí)生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖對(duì)DPPH·清除率顯著高于其他料液比的(P<0.05)。綜上，選取料液比為1∶10，1∶20，1∶30 (g/mL)進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖4 料液比對(duì)南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的 影響Figure 4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.4 接種量對(duì)植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖的影響

由圖5可知，生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖提取率隨植物乳桿菌接種量的增大逐漸降低，當(dāng)接種量為0.5%時(shí)南瓜多糖提取率最高，與接種量為1.0%時(shí)相比無(wú)顯著性差異，但與接種量為1.5%～2.0%時(shí)相比差異顯著(P<0.05)?？赡苁且?yàn)槿樗峋梢援a(chǎn)生如β-半乳糖苷酶、α-糖苷酶、α-葡糖苷酶以及α-甘露糖苷酶等相關(guān)的碳水化合物活性酶，降解南瓜多糖。當(dāng)接種量為1.5%時(shí)，生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖對(duì)DPPH·的清除率最高為(40.78±0.20)%，顯著高于接種量為0.5%～1.0%時(shí)的(P<0.05)，可能是較大的接種量對(duì)南瓜多糖分解過(guò)度產(chǎn)生了更多的小分子糖類(lèi)物質(zhì)，從而造成DPPH·清除率下降。綜上，選取接種量為1.0%，1.5%，2.0%進(jìn)行正交試驗(yàn)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖5 接種量對(duì)南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影響Figure 5 Effects of inoculation amount on extraction rate of pumpkin polysaccharide and DPPH·clearance rate

2.3 植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用L9(34)正交表，以DPPH·清除率為考察指標(biāo)，對(duì)植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。各因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of orthogonal test factors

由表2可知，各因素對(duì)DPPH·清除率的影響主要次序?yàn)閾u床轉(zhuǎn)速>料液比>溫度>接種量，微生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖最優(yōu)工藝組合為A2B3C3D2，即搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度42 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接種量1.5%，此條件下的生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖對(duì)DPPH·的清除率為(47.95±0.19)%；表2中試驗(yàn)5的DPPH·清除率最高，其生物轉(zhuǎn)化條件為搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度37 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接種量1.0%，此時(shí)DPPH·清除率為(54.61±1.58)%；因此植物乳桿菌生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖最佳工藝條件為搖床轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度37 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接種量1.0%。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Orthogonal test results

2.4 南瓜多糖與生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖的體外抗氧化性

表3 南瓜多糖與生物轉(zhuǎn)化南瓜多糖體外抗氧化性對(duì)比?Table 3 Antioxidant activity of pumpkin polysaccharide and biotransformed pumpkin polysaccharide

3 結(jié)論