微波輔助萃取藍(lán)莓花色苷工藝優(yōu)化及熱動(dòng)力學(xué)分析

翟賽亞 姚會(huì)敏

(河南質(zhì)量工程職業(yè)學(xué)院食品與化工學(xué)院，河南 平頂山 467000)

藍(lán)莓(Vacciniumspp.)富含花色苷[1]。大量研究表明花色苷可顯著清除過(guò)量自由基，具有較好抗氧化活性[2]，同時(shí)可抑制相關(guān)炎癥發(fā)生[3]和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[4]。目前，主要利用回流提取法提取植物基的花色苷，但該方法萃取效率低，溶劑消耗較大，耗時(shí)長(zhǎng)。為提高花色苷萃取率，并克服傳統(tǒng)萃取的缺點(diǎn)，一些具有發(fā)展?jié)摿Φ妮腿〖夹g(shù)被用于花色苷的提取中，如微波輔助提取(Microwave-assisted extraction，MAE)、超聲波輔助萃取、超臨界萃取和超高壓輔助萃取等技術(shù)，其中MAE具有萃取得率高、節(jié)能環(huán)保、溶劑消耗少和過(guò)程易控制等優(yōu)點(diǎn)[5]，該技術(shù)被成功應(yīng)用到黃酮類[6]、油脂類[7]、多酚類[8]等活性成分的提取中。

研究將在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化MAE藍(lán)莓花色苷的工藝參數(shù)。在此基礎(chǔ)上，利用Fick第一定律建立花色苷的傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)模型，依據(jù)Arrhenius方程和相變平衡原理，獲得萃取過(guò)程中的活化能(Ea)、熵變(ΔS)、焓變(ΔH)和吉布斯自由能變(ΔG)，分析MAE過(guò)程的熱力學(xué)，以期為藍(lán)莓花色苷進(jìn)一步深加工提供重要的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

美登藍(lán)莓：2020年采摘于東北小興安嶺地區(qū)，冷藏備用；

矢車菊-3-O-葡萄糖苷(C3G)：純度≥98.5%，寶雞市國(guó)康生物科技有限公司；

濃鹽酸、甲醇、無(wú)水乙醇：分析純，濟(jì)南涵百化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平：BSA224S-CW型，上海雙旭電子有限公司；

高級(jí)微波萃取系統(tǒng)：Milestone Ethos-8型，意大利milestone公司；

離心機(jī)：GL21M型，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；

精密數(shù)顯恒溫水浴鍋：J-HH-4A型，冠森生物科技(上海)有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：尤尼柯UV-3802S型，上海四藍(lán)儀器設(shè)備公司；

凍干機(jī)：LGJ-10FD型，北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藍(lán)莓前處理 首先將新鮮藍(lán)莓進(jìn)行挑選、除雜和清洗后，打漿，置于-20 ℃下預(yù)凍12 h后，冷凍干燥(至干基含水率低于5%)并粉碎，過(guò)40目篩，封裝，于4 ℃下避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 萃取 以2.00 g藍(lán)莓果粉為原料，按m藍(lán)莓果粉∶V乙醇為1∶30 (g/mL)添加體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇并混勻，置于微波工作站進(jìn)行提取，待萃取結(jié)束后進(jìn)行離心(5 000 r/min，15 min)，取上清液，所得殘?jiān)貜?fù)上述操作3次，合并提取液，用于花色苷得率測(cè)定。

1.3.3 花色苷萃取率的測(cè)定 參考Shen等[9]的方法。

(1)

(2)

式中：

C——花色苷質(zhì)量濃度，mg/mL；

ΔApH 1.0——pH 1.0時(shí)提取液在510 nm和700 nm處的吸光度差值；

ΔApH 4.5——pH 4.5時(shí)提取液在510 nm和700 nm處的吸光度差值；

f——稀釋倍數(shù)；

y——花色苷提取率，%；

Mω——矢車菊-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量，g/mol；

ε——矢車菊素-3-O-葡萄糖苷的摩爾吸光系數(shù)，L/(cm·mol)；

L——光程，cm；

V——提取液體積，mL；

m——藍(lán)莓粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

(1) 萃取溫度對(duì)藍(lán)莓花色苷提取率的影響：固定萃取時(shí)間為6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶30 (g/mL)，萃取溫度分別設(shè)置為30，40，50，60，70 ℃。

(2) 萃取時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花色苷提取率的影響：固定萃取溫度為50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%、料液比為1∶30 (g/mL)，萃取時(shí)間分別設(shè)置為2，4，6，8，10 min。

(3) 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)藍(lán)莓花色苷提取率的影響：固定萃取溫度為50 ℃、萃取時(shí)間為6 min、料液比為1∶30 (g/mL)，乙醇體積分?jǐn)?shù)分別設(shè)置為40%，50%，60%，70%，80%。

(4) 料液比對(duì)藍(lán)莓花色苷提取率的影響：固定萃取溫度為50 ℃、萃取時(shí)間為6 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%，料液比(m藍(lán)莓果粉∶V乙醇)分別設(shè)置為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇的自變量分別為萃取溫度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比，響應(yīng)值為花色苷萃取率(Y)?；赗SM中的Box-Behnken進(jìn)行設(shè)計(jì)。

1.3.6 遺傳算法設(shè)計(jì) 選取萃取溫度(X1)、萃取時(shí)間(X2)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)和料液比(X4)4個(gè)因素為決策變量，即：

X=X(X1，X2，X3，X4)。

(3)

(4)

(5)

遺傳算法優(yōu)化花色苷提取工藝的約束條件如式(6)所示。

(6)

1.4 花色苷萃取動(dòng)力學(xué)

在MAE藍(lán)莓花色苷的過(guò)程中，花色苷在藍(lán)莓顆粒內(nèi)溶解，然后由藍(lán)莓顆粒內(nèi)擴(kuò)散到顆粒表面，進(jìn)而擴(kuò)散到主體溶液中的過(guò)程[10]。在MAE過(guò)程中花色苷濃度變化如圖1所示。

圖1 萃取過(guò)程中花色苷濃度變化Figure 1 Changes of anthocyanins concentration in the extraction process

根據(jù)Fick第一定律，在任意t時(shí)刻通過(guò)固液界面的傳質(zhì)通量J為：

(7)

(8)

式(8)表明花色苷的擴(kuò)散速率與傳質(zhì)表面積和質(zhì)量濃度梯度呈正比。

某時(shí)刻質(zhì)量濃度梯度隨時(shí)間的遞減速率與該時(shí)刻濃度梯度呈正比[11]。

(9)

式中：

k——花色苷的提取速率常數(shù)。

對(duì)式(9)進(jìn)行積分可得：

(10)

將式(8)和式(10)聯(lián)立可得：

(11)

(12)

依據(jù)R2和標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差(Standard Error of Estimate，SEE)作為評(píng)價(jià)提取動(dòng)力模型，其表達(dá)式分別如式(13)和式(14)所示。

(13)

(14)

式中：

ESE——標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差；

YAC——花色苷含量的試驗(yàn)值，mg/mL；

1.5 花色苷的提取熱力學(xué)

花色苷微波萃取過(guò)程中符合相變平衡，其表達(dá)式如式(15)所示。

(15)

根據(jù)式(15)計(jì)算出組分的分配系數(shù)K，隨后將K數(shù)據(jù)代入van’t Hoff方程中，可以計(jì)算出MAE過(guò)程中ΔH和ΔS。

(16)

利用式(17)可計(jì)算MAE過(guò)程中的ΔG。

ΔG=ΔH-TΔS。

(17)

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 12.0對(duì)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析；利用Matlab R2018b軟件優(yōu)化提取工藝以及對(duì)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行求解；利用Design Expert 8.0軟件設(shè)計(jì)MAE藍(lán)莓花色苷的組合試驗(yàn)；利用Origin 9.0Pro對(duì)單因素試驗(yàn)進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波萃取條件對(duì)藍(lán)莓中花色苷萃取率的影響

由圖2(a)可知，當(dāng)萃取溫度在50 ℃以下時(shí)，花色苷萃取率隨萃取溫度的增加而顯著增加，在50 ℃時(shí)，花色苷萃取率達(dá)到最大值(80.52±1.75)%。其原因是萃取溫度增加有助于更多的花色苷被溶出，同時(shí)擴(kuò)散系數(shù)增加，使得花色苷在萃取液中溶解度最大[12]。當(dāng)萃取溫度繼續(xù)上升時(shí)，花色苷萃取率卻顯著降低(P<0.05)，可能與花色苷屬于熱敏性成分，高溫破壞了其結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。綜合考慮萃取溫度選擇40，50，60 ℃ 3個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)(見表1)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)圖2 單因素對(duì)花色苷萃取率的影響Figure 2 Effects of single factor on extraction rate of anthocyanins

由圖2(b)可知，當(dāng)萃取時(shí)間小于6 min時(shí)，花色苷萃取率隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)而增加，在6 min時(shí)，花色苷萃取率達(dá)到最大值(80.11±1.64)%。但當(dāng)萃取時(shí)間超過(guò)6 min時(shí)，萃取時(shí)間越長(zhǎng)，越不利于花色苷的提取。這可能是由于花色苷不穩(wěn)定，易被空氣中的氧氣氧化造成其結(jié)構(gòu)的破壞，導(dǎo)致花色苷萃取率降低[14]。綜上萃取時(shí)間選擇4，6，8 min 3個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)(見表1)。

表1 單因素試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Single factor experimental results

由圖2(c)可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%～60%時(shí)，隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加花色苷萃取率顯著增加(P<0.05)；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%時(shí)，花色苷萃取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而顯著降低(P<0.05)。其原因可能是隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加花色苷在萃取液中溶解度和擴(kuò)散系數(shù)增加，有助于花色苷的提取[15]。但高濃度的乙醇會(huì)加快雜質(zhì)的溶解，導(dǎo)致花色苷的溶解度降低，從而使得花色苷萃取率降低[16]。因此，乙醇體積分?jǐn)?shù)選擇40%，50%，60% 3個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)(見表1)。

由圖2(d)可知，當(dāng)料液比在1∶30～1∶40 (g/mL)范圍內(nèi)，花色苷萃取率隨料液比增加呈先顯著增加后顯著降低(P<0.05)。在1∶30 (g/mL)時(shí)，花色苷萃取率取得最大值。因此選擇料液比在1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL) 3個(gè)水平進(jìn)行組合試驗(yàn)(見表1)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 RSM模型構(gòu)建和顯著性檢驗(yàn) 試驗(yàn)方案和結(jié)果見表2。以花色苷萃取率Y為響應(yīng)值，剔除不顯著的因素，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，所得方程如式(18)所示。

表2 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results of RSM

(18)

表3 回歸模型系數(shù)的方差分析?Table 3 Variance analysis of regression model coefficients

2.2.2 兩因素的交互作用對(duì)花色苷萃取率的影響 綜合圖3各因素對(duì)花色苷萃取率的交互作用影響得知，當(dāng)萃取溫度在45～55 ℃、萃取時(shí)間5～7 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)45%～55%、料液比在1∶25～1∶35 (g/mL)條件下，藍(lán)莓花色苷萃取率較高。

圖3 試驗(yàn)因素的交互作用對(duì)花色苷萃取率的影響Figure 3 Effects of interaction of test factors on the yield of anthocyanins

2.2.3 MAE藍(lán)莓花色苷的工藝參數(shù)優(yōu)化 利用Matlab R2018b軟件中的遺傳算法工具箱優(yōu)化花色苷的提取工藝，其結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，當(dāng)?shù)?3次，花色苷萃取率達(dá)到最大值，此時(shí)萃取溫度、萃取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比水平編碼分別為1，1，0.702，0.16，即試驗(yàn)水平分別為60 ℃、8 min、57.02%和1∶31.6 (g/mL)，花色苷萃取率的理論值為84.40%。

圖4 遺傳算法的優(yōu)化結(jié)果Figure 4 The results optimized by the genetic algorithm

2.2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證遺傳算法的可靠性，結(jié)合實(shí)際情況，將工藝參數(shù)修正為：萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間8 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%和料液比1∶32 (g/mL)，在上述參數(shù)下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，所得花色苷萃取率試驗(yàn)值(83.15±2.03)%，試驗(yàn)值和理論值的相對(duì)誤差為1.48%。

說(shuō)明采用遺傳算法優(yōu)化MAE藍(lán)莓花色苷工藝參數(shù)是可行的。

2.3 動(dòng)力學(xué)模型的求解

依據(jù)不同萃取溫度下花色苷萃取動(dòng)力學(xué)結(jié)果，將ln[C∞/(C∞-C)]對(duì)萃取時(shí)間t進(jìn)行作圖，其結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，隨萃取時(shí)間延長(zhǎng)，ln[C∞/(C∞-C)]的值顯著增加，且在相同萃取時(shí)間內(nèi)，萃取溫度越高，ln[C∞/(C∞-C)]的值越大。

對(duì)圖5的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸，分別得到提取速率常數(shù)(k)、常數(shù)(c)，通過(guò)R2和SEE大小來(lái)判斷模型的精度，不同萃取溫度下，回歸結(jié)果如表4所示。由表4可知，隨著萃取溫度的增加，c和提取速率常數(shù)k均增加。ln[C∞/(C∞-C)]與t之間的R2>0.99，SEE<4.20。結(jié)果表明所建立的花色苷萃取動(dòng)力學(xué)模型能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)不同提取溫度下花色苷萃取效果。

圖5 不同萃取溫度與萃取時(shí)間的動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果Figure 5 Kinetic fitting results of different extraction temperature and extraction time

在MAE過(guò)程中，提取速率常數(shù)k與萃取溫度符合Arrhenius方程，如式(19)所示[17]。

(19)

將式(19)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)，可得式(20)。

(20)

將表4中的k值，代入式(20)中，然后通過(guò)lnk對(duì)1/T進(jìn)行線性擬合作圖，如圖6所示，由于直線的斜率為Ea/R，

表4 不同萃取溫度下ln[C∞/(C∞-C)]與萃取時(shí)間t的回歸結(jié)果Table 4 Regression equations between ln[C∞/(C∞-C)] and t at different temperatures

截距為lnA0，因此通過(guò)擬合方程計(jì)算出Ea和A0值。

由圖6可知，所得的擬合方程為lnk=-4 872.24/T+7.46，R2=0.872 5。通過(guò)擬合方程可以計(jì)算出MAE過(guò)程中的活化能Ea為40.51 kJ/mol，A0為1 737.15。微波萃取的活化能比溶劑萃取[18]的低。結(jié)果表明微波能降低萃取體系內(nèi)的Ea，從而強(qiáng)化植物細(xì)胞內(nèi)活性成分的提取。

圖6 不同溫度與提取速率常數(shù)擬合關(guān)系Figure 6 Fitting relationship between different temperature and extraction rate constant

2.4 花色苷提取的熱力學(xué)分析

根據(jù)式(16)作lnK與1/T圖，直線斜率為-ΔH/R，截距為ΔS/R(圖7)。由圖7可知，線性擬合的回歸方程為lnK=22.93-5.06/T，R2=0.993 0，擬合曲線的斜率為-ΔH/R，截距為ΔS/R，通過(guò)回歸方程計(jì)算得出ΔH為42.07 J/mol和ΔS為190.64 J/mol。在MAE過(guò)程中ΔH和ΔS均大于零，說(shuō)明MAE屬于吸熱熵增加的過(guò)程。

圖7 不同溫度與分配系數(shù)的擬合關(guān)系Figure 7 Fitting relationship between different temperatures and distribution coefficient

由表5可知，隨萃取溫度增加，ΔG逐漸減小，且均小于零，說(shuō)明微波在不同溫度下提取過(guò)程是一個(gè)自發(fā)過(guò)程。

表5 花色苷提取過(guò)程中自由能變Table 5 Free energy changes for anthocyanins extractionat different temperatures

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面耦合遺傳算法優(yōu)化微波輔助萃取藍(lán)莓花色苷的工藝，得到最優(yōu)工藝參數(shù)為萃取溫度60 ℃、萃取時(shí)間8 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)57%和料液比1∶32 (g/mL)，花色苷萃取率(83.15±2.03)%；通過(guò)微波輔助萃取藍(lán)莓花色苷的動(dòng)力學(xué)模型發(fā)現(xiàn)提取速率常數(shù)隨萃取溫度的增加而增大；在微波輔助萃取過(guò)程中，Ea、ΔS和ΔH分別為40 510.00，42.07，190.64 J/mol，ΔG小于零，說(shuō)明微波輔助萃取過(guò)程屬于吸熱、熵增加、自發(fā)的過(guò)程。