液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定食用油脂中天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素的不確定度評定

黃 輝 廖燕芝

(1. 湖南省市場監(jiān)督管理局缺陷產(chǎn)品召回服務中心，湖南 長沙 410111；2. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，湖南 長沙 410006)

辣椒中含有天然辣椒素、二氫辣椒素、降二氫辣椒素、高二氫辣椒素、高辣椒素、諾香草胺等含辣味的同系物[1]，其中天然辣椒素和二氫辣椒素含量占其總量的90%[2-3]以上，合成辣椒素是人工合成的具有類似天然辣椒素生物學功能的化合物[4]。辣椒素類物質(zhì)易溶于油脂，且在烹飪過程中具有很好的熱穩(wěn)定性。正常成品食用油脂不含有辣椒素類物質(zhì)，烹飪辣椒和辣椒調(diào)味料后的食用油脂中常含有辣椒素類物質(zhì)。因此，測定食用油脂中天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素含量，可以鑒別食用油脂是否為餐廚廢油進行加工提煉的劣質(zhì)食用油或添加了餐廚廢油的劣質(zhì)食用油[5]。當使用檢測結(jié)果作為判定依據(jù)時，必須了解檢測結(jié)果的可靠性。其中常用的一個度量參數(shù)就是測量不確定度。通過評定測量結(jié)果的不確定度[6-8]可確保檢測結(jié)果的可靠性和鑒定結(jié)果的科學合理性。目前有關食用油脂中3種辣椒素含量的測量結(jié)果進行不確定度評定[9-12]尚未見報道。研究擬采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[13]測定食用油脂天然辣椒素、二氫辣椒素和合成辣椒素含量，依據(jù)《化學分析中不確定度的評估指南》(CNAS-GL006: 2019)識別測量不確定度的主要來源，并對每一個來源的不確定度進行評估，以期提高該檢測結(jié)果的可靠性，為食用油脂質(zhì)量的鑒定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然辣椒素標準品：純度99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司；

合成辣椒素標準品、二氫辣椒素：純度98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色譜純，德國默克化工公司；

甲酸：色譜純，阿拉丁試劑(上海)有限公司；

二氯甲烷、氫氧化鈉、硫酸：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

食用油：市售。

1.2 儀器與設備

液相色譜—質(zhì)譜連用儀：Agilent 6460型，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超純水儀：Milli-Q型，美國密理博公司；

氮吹儀：N-ECAP45型，美國Organomation 公司；

固相萃取裝置：HSE-24B型，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理 準確稱取1 g(精確至0.000 1 g)食用油于10 mL具塞離心試管中，分別加入1 mL二氯甲烷和3 mL 2%氫氧化鈉溶液，渦旋提取10 min，10 000 r/min離心5 min，取上層水相；殘留有機相用3 mL 2%氫氧化鈉溶液重復提取一次，合并水相，再用稀硫酸(V硫酸∶V水=1∶15)溶液調(diào)節(jié)pH至2.5后進行下一步固相萃取。分別采用3 mL乙腈淋洗C18固相萃取小柱(規(guī)格1 000 mg/6 mL)3次進行活化，3 mL純水淋洗2次平衡固相萃取柱，將提取液加入SPE小柱，3 mL超純水淋洗2次，3 mL乙腈洗脫2次，接收洗脫液。洗脫液50 ℃水浴氮吹近干，用1 mL A級移液管準確移取0.50 mL甲醇溶解后過0.22 μm微孔濾膜，濾液為LC-MS/MS待測液[12]。

1.3.2 儀器條件

(1) 色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)；流動相及梯度洗脫條件見表1；流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10.0 μL。

表1 流動相及梯度洗脫條件Table 1 Mobile phase and gradient system conditions

(2) 質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI源)；正離子掃描；多反應監(jiān)測MRM；離子噴霧電壓4 000 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量9 L/min；霧化氣壓力276 kPa；化合物定量和定性離子見表2。

表2 化合物定性、定量離子和質(zhì)譜分析參數(shù)Table 2 Compound qualitative, quantitative ion and mass spectrometry parameters

1.3.3 標準曲線的制作 分別精確稱取合成辣椒素標準品0.025 16 g，天然辣椒素標準品0.025 40 g，二氫辣椒素標準品0.025 39 g，于3個25 mL A級容量瓶，加入適量甲醇溶解，定容后搖勻，得到質(zhì)量濃度為1.000 mg/mL標準儲備液。分別用1 mL A級移液管準確移取1.00 mL 3種標準儲備液于100 mL容量瓶(A級)中，用甲醇稀釋至質(zhì)量濃度為10.00 μg/mL混合標準中間液[14]。用1 mL A級移液管準確移取10.00 μg/mL混合標準工作液0.10 mL于100 mL容量瓶，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為1 000 ng/mL混合標準使用液。用1 mL A級移液管分別準確移取10.00 ng/mL混合標準使用液，配制成0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 ng/mL系列混合標準工作液，過0.22 μm尼龍膜，供液LC-MS/MS測定。

2 試驗與結(jié)果

2.1 數(shù)學模型

按式(1)計算辣椒油中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素含量。

(1)

式中：

X——試樣中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素含量，μg/kg；

v——試樣定容體積，mL；

c——測定試液中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素的質(zhì)量濃度，ng/mL；

c0——空白試液中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素的質(zhì)量濃度，ng/mL；

1 000——單位換算系數(shù)；

f——稀釋倍數(shù)。

2.2 測量不確定度來源分析

由檢測過程和數(shù)學模型可知，食用油脂中辣椒素類物質(zhì)含量測定的不確定度來源主要包括標準物質(zhì)的純度和稱量、混合標準工作液的配制和稀釋、標準曲線的擬合、樣品的稱量和定容、儀器的測定，以及檢測回收率和測量重復性[15]。

2.3 測量不確定度分量的評定

表3 標準物質(zhì)純度引入的相對不確定度Table 3 Uncertainty introduced by each measuring tool

表4 標準物質(zhì)稱量引入的相對不確定度Table 4 Uncertainty introduced by each measuring tool

2.3.3 混合標準工作液配制和稀釋引入的不確定度

(1) 標準儲備液定容引入的不確定度：配制標準儲備液需要使用25 mL A級容量瓶3個，該過程引入的不確定度來源于容量瓶的校準和溫度，根據(jù)《常用玻璃量器》

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行分析。以描述性與推論性統(tǒng)計的百分比、平均值、標準偏差、t檢驗、皮爾森積差相關分析與單因子變異數(shù)分析來呈現(xiàn)醫(yī)護人員在相關因素的分布情形、個人基本資料與其認知及3個相關因素結(jié)構面間的相關性。

(2) 配制混合標準工作液引入的不確定度：配制混合標準中間液、混合標準工作液過程中，使用1 mL A級移液管6根，5 mL A級移液管2根、10 mL容量瓶6個、100 mL容量瓶2個，量具引入的相對不確定度計算方法同2.3.3(1)，結(jié)果見表5。

表5 各量具引入的不確定度Table 5 Uncertainty introduced by each measuring tool

2.3.4 標準曲線擬合引入的不確定度 混合標準工作液系列質(zhì)量濃度分別為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 ng/mL，對混合標準工作液的每個濃度點重復測定3次，用最小二乘法對混合標準工作液的濃度與峰面積進行擬合，得到線性回歸方程，通過式(2)計算殘差標準差s，再按式(3)計算擬合標準曲線得出標準不確定度，結(jié)果見表6。

(2)

表6 線性回歸方程Table 6 Linear regression equation

(3)

式中：

Aj——第i個標準溶液的第j次計數(shù)值；

B1——線性方程的斜率；

B0——線性方程截距；

Ci——第i個標準溶液的質(zhì)量濃度，μg/mL；

C0——樣品的平均質(zhì)量濃度，μg/mL；

urel(s)——標準曲線引入的標準不確定度；

S——工作液峰面積殘差的標準差；

P——樣品溶液的測量次數(shù)，7；

n——標準溶液的測量次數(shù)，21。

2.3.6 樣品待測液定容引入的不確定度 樣品提取凈化液氮吹近干，用1 mL A級移液管準確移取0.50 mL甲醇溶解，得到樣品待測液。20 ℃時甲醇的膨脹系數(shù)為1.18×10-3℃-1，計算過程同2.3.3(3)，則樣品待測液定容引入的不確定度為urel(v6)=0.005 7。

2.3.8 重復測定樣品引入的不確定度 取加標樣品重復檢測7次(n=7)，則重復測定樣品引入的標準偏差和相對標準不確定度見表7。

表7 重復測定引入的不確定度Table 7 Uncertainty introduced by repeated determination

2.3.9 樣品回收率引入的相對不確定度 對空白試樣進行加標試驗(n=7)，天然辣椒素添加量為0.225 μg/kg，合成辣椒素添加量為0.45 μg/kg，二氫辣椒素添加量為0.225 μg/kg，則樣品回收率引入的標準偏差和相對標準不確定度見表8。

表8 樣品回收率引入的不確定度Table 8 Uncertainty introduced by sample recovery

使用加標回收率校正因子后，測定食用油中合成辣椒素含量X=0.215/0.86=0.250，天然辣椒素含量X=0.116/0.946=0.123，二氫辣椒素含量X=0.115/0.883=0.130。

2.3.10 合成相對標準不確定度 合成上述各不確定度分量得到相對合成不確定度，該測量誤差的分布類型屬正態(tài)分布，在置信水平為95%時，取k=2，故擴展不確定度U=urel×k×X計算得出擴展不確定度見表9。

表9 不確定度評定Table 9 Uncertainty introduced by sample recovery

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定油脂中辣椒素類含量測定結(jié)果表示為：合成辣椒素含量(0.250±0.032) μg/kg，天然辣椒素含量(0.123±0.015) μg/kg，二氫辣椒素含量(0.130±0.014) μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

通過建立數(shù)學模型，對液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法測定食用油脂中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素可能引入的不確定度分量進行了評定。從評定結(jié)果可知，測定過程中不確定度的主要來源于標準曲線擬合和儀器測定，因此，在實際檢測中可以通過優(yōu)化標準曲線的配制，定期對測定儀器進行維護保養(yǎng)，減小測量結(jié)果的不確定度，從而提高檢測結(jié)果的準確度，該評定方法可為液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法測定食用油脂中合成辣椒素、天然辣椒素和二氫辣椒素含量的測量及結(jié)果判定提供參考。今后需要進一步提高檢驗人員試驗操作水平、定期對測定儀器進行維護，期間核查和檢定以提高儀器的穩(wěn)定性和精密度，從而減小測定結(jié)果的不確定度。