高效液相色譜法檢測(cè)藥品糖漿劑中4種人工合成甜味劑

鐘菲菲 雷德卿 周金沙 劉 波 王子倩

(長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410008)

人工合成甜味劑是一類(lèi)應(yīng)用較廣泛的食品添加劑，主要有糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜、甜蜜素、三氯蔗糖等[1]。過(guò)量攝入人工合成甜味劑可能損害人的肝臟、神經(jīng)、消化系統(tǒng)，甚至引發(fā)癌癥[2-4]，嬰幼兒更容易受到不可逆損傷[5]。

食品中人工合成甜味劑檢測(cè)手段較多[4,6]，主要有毛細(xì)管電泳法[7]、離子色譜法[8]、氣相色譜法[9]、高效液相色譜法[10-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]等。毛細(xì)管電泳法及離子色譜法靈敏度低，重現(xiàn)性差，易受樣品中其他組分干擾；氣相色譜法通常需要柱前衍生化，操作較繁瑣；高效液相色譜—質(zhì)譜法儀器昂貴，且受樣品基質(zhì)影響明顯。目前食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn)主要是檢測(cè)單組分的甜味劑，往往一個(gè)方法適用于一種組分，同時(shí)檢測(cè)多種非法添加食品甜味劑的方法尚未見(jiàn)諸于報(bào)道。因此，亟需建立一種準(zhǔn)確簡(jiǎn)單的方法同時(shí)測(cè)定多種人工合成甜味劑。

小兒止咳糖漿以藥食同源的甘草和桔梗等為原料，處方中蔗糖含量為65 g/100 mL[17]。但藥用輔料蔗糖來(lái)源于天然產(chǎn)物，價(jià)格昂貴，因此一些商家為降低成本使用糖精鈉等人工合成甜味劑替代蔗糖。研究擬以小兒止咳糖漿為例，在探索前處理方法的基礎(chǔ)上，建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定藥品糖漿劑中安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜4種食品甜味劑，以期為食品甜味劑安全研究和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供參考，為科學(xué)監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈：色譜純，批號(hào)JA110130，美國(guó)默克公司；

甲醇：色譜純，批號(hào)L1147507 117，德國(guó)默克公司；

超純水：自制并經(jīng)檢測(cè)符合規(guī)定；

小兒止咳糖漿樣品：來(lái)源于21家生產(chǎn)企業(yè)共45批次；

安賽蜜標(biāo)準(zhǔn)品：純度99.4%，批號(hào)G1012337，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)品：純度86.2%，批號(hào)510208-202001，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

阿斯巴甜標(biāo)準(zhǔn)品：純度95.0%，批號(hào)510206-202001，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；

愛(ài)德萬(wàn)甜標(biāo)準(zhǔn)品：純度97.0%，批號(hào)102278222，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：Waters alliance e2695型，美國(guó)Waters公司；

電子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

純化水系統(tǒng)：Millipore Milli-Q Direct 8型，美國(guó)密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱為Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.02 mol/L磷酸二氫銨(用三乙胺調(diào)節(jié)pH值至5.5)為流動(dòng)相B，梯度洗脫(洗脫程序：0 min，2% A，98% B；10 min，5% A，95% B；30 min，45% A，55% B；40 min，45% A，55% B；41 min，2% A，98% B；50min，2% A，98% B)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 供試品溶液的制備 精密量取糖漿劑樣品1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇適量，搖勻，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即可。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取安賽蜜25.39 mg，糖精鈉28.88 mg，阿斯巴甜26.27 mg，愛(ài)德萬(wàn)甜25.21 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液(每1 mL含各組分約為1 mg)。精密量取貯備液0.2，0.5，1，1，1，1 mL分別置100，100，100，50，20，10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，每1 mL含各組分約為2，5，10，20，50，100 μg。

1.3.4 樣加標(biāo)溶液的制備 因無(wú)實(shí)際樣品同時(shí)含安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜4種組分，取一批樣品45 mL，加上述貯備液5 mL，渦旋混勻，其余按2.2項(xiàng)同法操作，作為樣加標(biāo)溶液(每1 mL含各組分約為100 μg)，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法優(yōu)化

比較乙腈、水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇作為稀釋劑的效果。其中：用乙腈作為稀釋劑時(shí)，樣品不能均勻分散，明顯成團(tuán)；用水、10%甲醇、30%甲醇作為稀釋劑，振搖時(shí)產(chǎn)生大量氣泡，久置不散；用50%以上甲醇溶液作稀釋劑，能均勻分散，沒(méi)有或產(chǎn)生少量氣泡，靜置即散。由于初始流動(dòng)相中水相比例高，當(dāng)樣品溶液有機(jī)相濃度過(guò)高易引起溶劑效應(yīng)，故選擇50%甲醇作為稀釋劑。

2.2 色譜條件優(yōu)化

2.2.1 pH 調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值分別為4.5，5.5，6.5，7.5，結(jié)果表明pH值5.5時(shí)峰形對(duì)稱(chēng)，分離效果良好。4種目標(biāo)物分子中均含有仲氨基團(tuán)，愛(ài)德萬(wàn)甜和阿斯巴甜分子中含有羧基，糖精鈉和甜蜜素分子中含磺酸基，均呈現(xiàn)酸堿兩性，在強(qiáng)酸或強(qiáng)堿環(huán)境下，分子主要呈解離態(tài)，峰形拖尾嚴(yán)重，弱酸條件下，分子主要呈游離態(tài)，峰形良好，故選擇pH值5.5。

2.2.2 磷酸二氫銨濃度 比較了流動(dòng)相中不同磷酸二氫銨濃度(0.005，0.010，0.020，0.050，0.100 mol/L)下的峰形和分離效果，結(jié)果：0.005,0.010 mol/L的分離效果和峰形均較差，0.020,0.050,0.100 mol/L的分離效果和峰形均良好，考慮鹽濃度過(guò)高對(duì)儀器和色譜柱的損傷，故選擇0.020 mol/L的磷酸二氫銨。

2.2.3 色譜柱型號(hào) 考察4個(gè)品牌型號(hào)的色譜柱(Waters symmetry-C18、Agilent TC-C18、Inerstil ODS-SP-C18、Shiseido AQ-C18，規(guī)格均為4.6 mm×250 mm, 5 μm)對(duì)分離效果的影響，分離效果均良好，由于AQ-C18柱耐高水相，建議選用。

2.2.4 流速 比較丁流動(dòng)相流速對(duì)峰形和分離效果。結(jié)果表明：流動(dòng)相流速過(guò)低，縱向分子擴(kuò)散嚴(yán)重，影響峰形和分離效能，提高流速可以有效減少縱向分子擴(kuò)散，改善峰形提高分離效能；但流速過(guò)高，會(huì)增加傳質(zhì)阻力，降低分離效能，且會(huì)增加柱壓損壞色譜柱。其他條件不變，流速在0.8～1.2 mL/min范圍內(nèi)，縱向分子擴(kuò)散與傳質(zhì)阻力達(dá)到較好的平衡狀態(tài)，4種待測(cè)組分分離良好。

2.2.5 柱溫 考察了柱溫(30,35,40 ℃)對(duì)色譜分離效果的影響，結(jié)果顯示在試驗(yàn)范圍內(nèi)柱溫對(duì)分離效果、保留時(shí)間、峰形、柱壓影響不大。提高柱溫，雖然可以減少流動(dòng)相黏滯性，但對(duì)于降低傳質(zhì)阻力作用并不明顯，而4種待測(cè)組分熱穩(wěn)定性好，無(wú)需控制低溫，因此無(wú)需嚴(yán)格控制柱溫，建議使用柱溫箱保持柱溫恒定即可。

2.3 線(xiàn)性范圍、檢出限與定量限

取標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)工作溶液，按1.3.1的色譜條件測(cè)定4個(gè)組分，以質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜4種組分在質(zhì)量濃度為2～100 mg/L范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999。以信噪比S/N=3計(jì)算檢出限，S/N=10計(jì)算定量限，4種組分線(xiàn)性范圍與檢測(cè)限見(jiàn)表1。由表1可知，檢出限和定量限均較低，可見(jiàn)該法靈敏度較好。

表1 4種組分線(xiàn)性范圍與檢測(cè)限Table 1 Linearity range and detection limit of four components (n=6)

2.4 專(zhuān)屬性

取經(jīng)檢測(cè)不含4種待測(cè)成分的小兒止咳糖漿樣品溶液、樣加標(biāo)溶液、混合對(duì)照品溶液，按1.3.1的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，4種組分峰形對(duì)稱(chēng)，分離良好，保留時(shí)間合適，樣品中其他成分沒(méi)有干擾。

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果見(jiàn)表2，4種組分RSD均小于4%(n=6)，說(shuō)明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(yàn) Table 2 The test of precision (n=6)

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣加標(biāo)溶液，在0，2，4，8，12，16，20， 24 h進(jìn)樣，平行進(jìn)2針，以2針的平均峰面積計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表3，RSD均小于4%(n=8)，說(shuō)明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定，制備后24 h內(nèi)進(jìn)樣分析不影響結(jié)果。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 3 The test of stability (n=8)

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品(批號(hào)：170403)，按1.3.2的方法平行制備供試品溶液6份，按1.3.1的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明所建立方法重復(fù)性良好(見(jiàn)表4)。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)Table 4 The test of repeatability (n=6)

2.8 回收率試驗(yàn)

精密量取供試品(批號(hào)：170403)1 mL，置10 mL容量瓶中，平行量取9份，分為高、中、低3個(gè)組，高、中、低組分別精密加入100 μg/mL的混合對(duì)照品溶液1.2，1.0，0.8 mL，置振蕩器混勻，按1.3.2的方法制備供試品溶液。

1. 安賽蜜 2. 糖精鈉 3. 阿斯巴甜 4. 愛(ài)德萬(wàn)甜圖1 4種目標(biāo)物的色譜圖Figure 1 Chromatogram of 4 kinds of target compounds

精密量取10 μL供試品溶液注入液相色譜儀，依法測(cè)定，按式(1)計(jì)算回收率。

(1)

式中：

p——回收率，%；

m1——測(cè)得加標(biāo)樣品中待測(cè)組分的質(zhì)量，μg；

m2——樣品中含待測(cè)組分的質(zhì)量，μg；

m0——加入待測(cè)組分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量，μg。

由表5可知，安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜平均回收率分別為98.65%，104.09%，100.96%，102.30%，RSD分別為1.4%，0.8%，1.4%，1.7%(n=9)，說(shuō)明所建立的方法回收率良好，準(zhǔn)確度高。

表5 回收率試驗(yàn)Table 5 The test of recovery (n=9)

2.9 樣品測(cè)定

按1.3.2的樣品制備方法和1.3.1的下色譜條件，測(cè)定45批次樣品，對(duì)樣品中出現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間一致的色譜峰，進(jìn)行純度測(cè)試和光譜指數(shù)圖一致性比較，能通過(guò)純度測(cè)試且與相應(yīng)對(duì)照品光譜指數(shù)圖一致，判定為檢出，其中3批次檢出愛(ài)德萬(wàn)甜，2批次檢出阿斯巴甜和愛(ài)德萬(wàn)甜，結(jié)果見(jiàn)表6，其他均未檢出。

表6 樣品測(cè)定結(jié)果Table 6 The results of sample determination mg/L

3 結(jié)論

建立了糖漿劑藥品中人工合成甜味劑含量測(cè)定方法，該方法可同時(shí)測(cè)定安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、愛(ài)德萬(wàn)甜4種組分，專(zhuān)屬性好、準(zhǔn)確可靠、操作簡(jiǎn)單、線(xiàn)性范圍寬，可用于糖漿劑質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)。下一步將繼續(xù)探索液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用定性方法，以液相色譜定量結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用定性建立補(bǔ)充檢驗(yàn)方法監(jiān)測(cè)糖漿劑藥品中非法添加人工合成甜味劑。