QuEChERS-氣相色譜—三重四極桿質譜法測定辣條中16種多環(huán)芳烴

李 莎 曾習文 申 睿 李亦蔚 譚 震

(1. 食品安全監(jiān)測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410000；2. 長沙縣食品藥品安全檢測中心，湖南 長沙 410100)

多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是指分子中含有兩個或兩個以上的芳香環(huán)的非極性或中等級性有機化合物[1]。食品中多環(huán)芳烴來源廣泛，一方面由被污染的水、空氣和土壤通過食物鏈遷移在食品原料中富集[2-3]；另一方面，食品原料在高溫烹調加工時會發(fā)生熱解或熱聚反應，形成PAHs[4-6]。PAHs具有很強的致癌性和基因毒性，嚴重影響生命健康，引起了世界各國的廣泛關注，已被列為污染嚴重的持久性污染物[7-9]。

國內外報道的食品中多環(huán)芳烴的檢測對象多以苯并[α]芘、PAH4(苯并[α]芘、苯并[b]熒蒽、苯并[α]蒽、屈)為主，涉及氣相色譜—質譜聯(lián)用法(GC-MS)[10]、高效液相色譜法[11-13]和氣相色譜—三重四級桿質譜法(GC-MS/MS)[14-15]等。與前兩種方法相比，氣相色譜—三重四級桿質譜法(GC-MS/MS)選擇性好、檢測靈敏度高，適用于復雜基質中痕量化合物的定性和定量分析。食品中多環(huán)芳烴的含量較低，有效提取多環(huán)芳烴尤為困難，因此樣品的前處理是整個檢測過程中最關鍵且最耗時的環(huán)節(jié)。已報道的前處理方法主要有索氏提取[16]、液液萃取[5]、固相萃取凈化[10]、凝膠滲透色譜凈化[17]、QuEChERS法[14]等。其中，QuEChERS技術具有操作簡便、快速、成本低、消耗有機溶劑少等優(yōu)點，近年來在污染物殘留檢測等領域得到了廣泛應用[18-19]。

辣條是一種廣受青睞的休閑小食品，以面粉、香辛料、食用油等為主要原料，通過擠壓膨化和調味制成。辣條生產過程中的擠壓膨化和調味油制作環(huán)節(jié)需經高溫烹制，由此可能帶來PAHs污染。目前有關QuEChERS結合GC-MS/MS技術檢測辣條中16種多環(huán)芳烴的分析方法鮮見文獻報道。研究擬采用QuEChERS前處理方法結合GC-MS/MS檢測技術開發(fā)一種快速測定辣條中16種多環(huán)芳烴的檢測方法，并對20批次市售辣條樣品進行檢測，旨在為辣條中多環(huán)芳烴污染風險預警和質量安全監(jiān)管提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 材料與試劑

16種多環(huán)芳烴混標(包含萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、熒蒽、芘、苯并[α]蒽、屈、苯并[b]熒蒽、苯并[k]熒蒽、苯并[α]芘、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[α,h]蒽、苯并[g,h,i]芘)：200 μg/mL，溶劑為正己烷，北京壇墨質檢有限公司；

正己烷、乙酸乙酯、乙腈：色譜純，德國默克公司；

PSA：粒徑40～63 μm，100 g/瓶，上海安譜實驗科學股份有限公司；

十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)：粒徑40～75 μm，100 g/瓶，上海安譜實驗科學股份有限公司；

中性氧化鋁：粒徑125 μm，100 g/瓶，上海迪馬科技有限公司；

Agilent J&W DB-EUPAH毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國Agilent公司；

辣條樣品：市售。

1.1.2 主要儀器設備

氣相色譜—三重四極桿質譜儀：Agilent 7890B-7000C型，美國Agilent公司；

超聲波清洗儀：KQ-500B型，昆山市超聲儀器有限公司；

渦旋振蕩器：XH-B型，江蘇健康醫(yī)療用品有限公司；

冷凍離心機：Eppendorf 5804R型，德國艾本德股份公司；

樣品濃縮儀：HN132型，濟南海能儀器有限公司；

高速多功能粉碎機：XY-100型，浙江省永康市松青五金廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制 準確移取0.5 mL 16種PAHs混合標準溶液至10 mL容量瓶中，用正己烷溶劑配置成10 μg/mL 的標準中間溶液。精確移取一定量的標準中間溶液，用正己烷溶劑或空白基質提取液逐級釋成混合標準工作液或基質匹配標準工作液，質量濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 μg/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2 儀器分析條件

(1) 色譜條件：Agilent J&W DB-EUPAH毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純氦氣(99.999%)；柱流速1.0 mL/min；進樣口溫度為300 ℃；程序升溫：初始溫度40 ℃保持2 min，以50 ℃/min升溫至200 ℃，再以5 ℃/min升溫至300 ℃，保持15 min；進樣量為1 μL；進樣方式為不分流進樣。

(2) 質譜條件：電離方式為電子轟擊離子源(EI)；電離能量70 eV；離子源溫度300 ℃；四級桿溫度150 ℃；傳輸線溫度300 ℃；掃描模式為多重反應監(jiān)測(MRM)。16種 PAHs的質譜參數見表1。

1.2.3 樣品前處理

(1) 提取：稱取粉碎的辣條樣品5.0 g置于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，再加入QuEChERS鹽析劑(含1.0 g NaCl和4.0 g無水硫酸鎂)，渦旋振蕩2 min，超聲輔助提取10 min，-20 ℃冷凍30 min，于4 000 r/min冷凍離心3 min，上清液轉移至50 mL 離心管中，按上述過程重復提取一次，合并上清液。

(2) 凈化：移取提取液約6 mL，置于15 mL離心管中，加入QuEChERS凈化劑(其中吸附劑為100 mg PSA，100 mg C18和1 000 mg中性氧化鋁)，渦旋振蕩2 min，再于4 000 r/min冷凍離心3 min，準確移取上清液4.0 mL于10 mL離心管中，40 ℃氮吹至近干，用正己烷溶解并定容至1.0 mL，過0.22 μm有機濾膜，供GC-MS/MS分析檢測，采用基質匹配外標法定量。

(3) 優(yōu)化試驗：在空白辣條樣品中添加100 μg/kg 16種 PAHs混合標準溶液制成加標樣品，按照上述方法進行檢測，分別單獨考察提取溶劑(正己烷、乙酸乙酯、乙腈)、超聲輔助提取時間(0，5，10，20 min)、凈化填料種類和用量(1號：100 mg PSA；2號：100 mg PSA+100 mg C18；3號：100 mg PSA+200 mg C18；4號：100 mg PSA+100 mg C18+1 000 mg 中性氧化鋁)對辣條中16種PAHs提取效果的影響。

1.2.4 基質效應評價 按照建立的方法，在相同的條件下同時測定不同濃度的混合標準工作液、基質匹配混合標準工作液，繪制標準曲線，按式(1)計算各組分的基質效應(ME值)[20]。

ME=(B-A)/A×100%，

(1)

式中：

ME——基質效應(ME值)，%；

A——溶劑標準曲線斜率；

B——基質標準曲線斜率。

1.2.5 線性關系 通過測定不同濃度的基質標準工作溶液，分別以16種PAHs的峰面積為縱坐標、各濃度點為橫坐標來繪制標準曲線。

1.2.6 檢出限及定量限的測定 在空白辣條樣品中添加一定濃度的16種PAHs混合標準溶液，以3倍信噪比(S/N=3)時對應的目標物濃度計算得到方法檢出限，以10倍信噪比(S/N=10)計算得到方法定量限。

1.2.7 回收率和精密度測定 在空白辣條樣品中分別添加16種PAHs混合標準溶液，添加水平為10，20，100 μg/kg，每個水平平行測定6次，分別計算平均回收率和精密度。

1.2.8 實際樣品測定 按照建立的方法對市售20批次辣條中16種PAHs含量進行測定。

1.3 數據處理

采用Agilent Mass Hunter軟件對16種PAHs進行數據采集及數據處理；用Excel軟件對條件優(yōu)化試驗數據、基質效應、回收率、精密度及樣品含量水平數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

采用氣質聯(lián)用方法分析PAHs時，通常采用HP-5MS或DB-EUPAH柱。由于苯并[b]熒蒽和苯并[k]熒蒽為同分異構體，茚并[1,2,3-c,d]芘與二苯并[α,h]蒽結構相似，在傳統(tǒng)的HP-5MS上無法完全分離。選用DB-EUPAH色譜柱對16種PAHs進行分離，在優(yōu)化后的色譜條件下16種PAHs可以實現(xiàn)分離，且峰型相對尖銳窄小。

采用全掃描模式對16種PAHs進行掃描，得到總離子流圖，根據質譜圖選擇2～3個特征離子作為母離子。對選定的母離子進行子離子掃描，選擇信噪比較高的特征離子對分別作為定性、定量離子對，同時優(yōu)化碰撞能量。優(yōu)化后的16種PAHs多反應監(jiān)測模式質譜參數及保留時間如表1所示，GC-MS/MS方法測定16種PAHs基質混合標準溶液的色譜圖見圖1。

表1 16種多環(huán)芳烴化合物的保留時間及MRM參數Table 1 Retention time and MRM parameters of 16 kinds of PAHs compounds

2.2 樣品前處理方法的考察

2.2.1 提取溶劑的選擇 由于辣條基質復雜，含有脂肪、糖類、色素等干擾物質較多，為了能盡可能地提高16種PAHs的提取效率、降低基質干擾，需要對提取溶劑種類進行優(yōu)化。分別采用正己烷、乙酸乙酯、乙腈對16種PAHs加標量為100 μg/kg的辣條樣品進行提取，按照1.2.3的方法凈化濃縮后測定目標物的含量，通過回收率結果來比較不同溶劑的提取效果。

1. 萘 2. 苊烯 3. 苊 4. 芴 5. 菲 6. 蒽 7. 熒蒽 8. 芘 9. 苯并[α]蒽 10. 屈 11. 苯并[b]熒蒽 12. 苯并[k]熒蒽 13. 苯并[α]芘 14. 茚并[1,2,3-c,d]芘 15. 二苯并[α,h]蒽 16. 苯并[g,h,i]芘圖1 16種多環(huán)芳烴混合基質標準溶液(0.20 μg/mL)的色譜圖Figure 1 The chromatograms of 16 kinds of PAHs mixed matrix standard solutions (0.20 μg/mL)

如圖2所示，乙腈作為提取溶劑時回收率明顯高于其他溶劑，達70.43%～103.30%。由于PAHs是一類極性較弱的脂溶性化合物，采用正己烷、乙酸乙酯作為提取溶劑時，提取液中油脂含量高，凈化后的樣品中油脂不能完全除盡，上機分析時會對GC-MS/MS系統(tǒng)造成污染，影響儀器的穩(wěn)定性；另外提取液中含油脂，由于沸點較高，在進樣口可能存在氣化不完全的現(xiàn)象，導致結果偏低。因此，選擇乙腈作為優(yōu)化的提取溶劑。

圖2 提取溶劑對辣條中16種多環(huán)芳烴提取效果的影響Figure 2 Effect of different solvents on the extraction efficiency of 16 kinds of PAHs in spicy strip

2.2.2 超聲輔助提取時間優(yōu)化 分別設置4個不同的超聲提取時間0，5，10，20 min，按照1.2.3對加標樣品進行測定，考察超聲時間對提取效率的影響。由圖3可知，在超聲輔助提取條件下的提取效果優(yōu)于未超聲提取的，超聲時間從0 min延長到10 min回收率均明顯升高。超聲時間從10 min延長到20 min時，各組分的回收率變化不大，且部分組分回收率下降。最終選擇超聲輔助提取時間為10 min。

圖3 超聲提取對辣條中16種多環(huán)芳烴提取效率的影響Figure 3 Effect of ultrasonic extraction on extraction efficiency the of 16 kinds of PAHs in spicy strip

2.2.3 凈化填料的優(yōu)化 選擇QuEChERS方法對樣品提取液進行凈化處理，常用的凈化填料包括PSA、C18、中性氧化鋁等。PSA可有效去除樣品中有機酸、糖類、脂肪酸和少量色素等；C18對極性弱的脂肪酸、色素等大分子物質有較強的吸附效果；中性氧化鋁常用于非極性劑及中等極性物質的吸附，具有很好的除脂能力[21]。凈化試劑及其用量根據不同基質類型來選擇，辣條提取液中基質一般為糖類、脂類、酸和色素等。研究主要考察了PSA、C18、中性氧化鋁不同配比的凈化填料對樣品的凈化效果，4組填料凈化后16種PAHs的回收率結果見圖4。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，隨著填料中凈化試劑種類及含量增加，溶液越來越澄清，但回收率結果不一。隨著C18凈化試劑用量的增大，16種PAHs的回收率降低，推斷可能由于C18吸附性較強，除雜的同時也會吸附待測化合物，C18的用量過大，反而造成待測化合物的回收率偏低。對比4組凈化填料凈化后的回收率結果，4號凈化填料(100 mg PSA+100 mg C18+1 000 mg中性氧化鋁)最優(yōu)，推斷可能中性氧化鋁去除油脂效果好，有利于基質的凈化。因此，選擇4號凈化填料作為優(yōu)化的QuEChERS凈化填料。

1號. 100 mg PSA 2號. 100 mg PSA+100 mg C18 3號. 100 mg PSA+200 mg C18 4號. 100 mg PSA+100 mg C18+1 000 mg 中性氧化鋁圖4 4組凈化填料凈化后16種PAHs回收率Figure 4 Recover rates of 16 kinds of PAHs after purification by four groups of purification packings

2.3 基質效應

采用正己烷溶劑和空白基質提取液分別配制成標準工作溶液，質量濃度分別為0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 μg/mL。在相同條件下進行檢測，按照1.2.4中式(1)計算ME值，通過ME值判斷基質效應[20]。由表2可知，16種組分的ME值在0.50%～23.23%，其中萘、苯并[α]蒽、苯并[b]熒蒽、苯并[α]芘的ME值均高于10%，表明基質效應顯著，辣條中16種PAHs測定方法需利用基質匹配外標法校正來消除基質效應，進行準確定量。

2.4 線性關系、相關系數和檢出限

采用基質空白將16種PAHs混合標準中間液配制成7個不同質量濃度的基質混合標準工作液，分別為0.005，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 μg/mL。采用建立的方法進行測定，以16種目標物的響應面積為縱坐標、濃度為橫坐標繪制標準曲線，結果如表2所示，16種PAHs在0.000 5～0.50 μg/mL濃度范圍線性關系良好，線性相關系數為0.998 4～0.999 9。分別以信噪比S/N為3和10所對應的濃度，計算各組分的檢出限和定量限，該方法檢出限在0.04～0.55 μg/kg，定量限在0.12～1.85 μg/kg(見表2)。

表2 辣條中16種多環(huán)芳烴的線性方程、相關系數、基質效應、檢出限、定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, matrixeffects (MEs), limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ) of 16 kinds of PAHs in spicy strip

2.5 方法的回收率和精密度

在空白樣品中分別添加16種PAHs混合標準溶液制成10，20，100 μg/kg三水平加標樣品，渦旋振蕩2 min，靜置2 h后，以建立的方法進行測定，每個水平平行測定6次，結果如表3所示，平均回收率為71.54%～103.70%，相對標準偏差(RSD)為2.4%～9.3%。

2.6 實際樣品測定

采用該方法對隨機抽取的20批次辣條樣品中16種多環(huán)芳烴含量進行測定，結果如表4所示，在14批次樣品中檢測出多環(huán)芳烴，除苊烯、蒽、苯并[b]熒蒽、茚并[1,2,3-c,d]芘、二苯并[α,h]蒽、苯并[g,h,i]芘未檢出外其他種類多環(huán)芳烴均有檢出。其中萘的平均含量最高，達8.27 μg/kg；其次是菲，平均含量為4.73 μg/kg，20批次樣品中多環(huán)芳烴總含量范圍為0.42～42.28 μg/kg，平均總含量為11.12 μg/kg。通過實際樣品檢測，辣條中多環(huán)芳烴有不同程度檢出，應引起食品安全監(jiān)管部門重視。

表4 辣條樣品中多環(huán)芳烴含量Table 4 The content of PAHs in spicy strip samples μg/kg

3 結論

試驗將QuEChERS前處理方法結合GC-MS/MS檢測技術應用于辣條中16種多環(huán)芳烴的快速分析檢測。結果表明，在0.005～0.50 μg/mL范圍內線性關系良好，線性相關系數均達0.998 4以上，檢出限和定量限分別在0.04～0.55 μg/kg和0.12～1.85 μg/kg；空白樣品中10，20，100 μg/kg三水平的平均加標回收率為71.54%～103.70%，相對標準偏差為2.4%～9.3%。該方法簡單、快速、選擇性好、靈敏度高，能夠滿足辣條中16種多環(huán)芳烴的日常檢測要求。隨機抽取的20批次辣條樣品中有14批次檢出多環(huán)芳烴，下一步工作中將對辣條中多環(huán)芳烴污染來源和影響因素進行進一步研究。