微波催陳對(duì)黑米酒中酚類、有機(jī)酸類和酯類含量的影響

湯林月 原江鋒,2,3 賴鈺婷 龔明貴,2,3 孫建瑞,2,3

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物資源開發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽 471023；3. 河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

黑米酒是以黑米為主要原料，糯米、黑豆等為輔料，甜酒曲和黃酒曲為發(fā)酵劑，經(jīng)灰霉菌和酵母菌發(fā)酵得到的低度飲料酒[1]。黑米酒富含多種營養(yǎng)成分，如維生素、氨基酸、微量元素、酚類、有機(jī)酸類、酯類化合物等[2]，且具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎癥、延緩衰老、調(diào)節(jié)生理節(jié)律、預(yù)防心腦血管疾病等保健功能[3]。

與其他酒類一樣，新釀的黑米酒需要陳化過程，在此過程中黑米酒的活性成分會(huì)發(fā)生一定變化，使其口感、風(fēng)味和色澤進(jìn)一步提升。傳統(tǒng)陳釀技術(shù)耗時(shí)長、成本高，因而限制了黑米酒企業(yè)的發(fā)展。微波催陳是近幾年發(fā)展起來的具有前景的催陳技術(shù)[4]，已被應(yīng)用于黑米酒的催陳研究中[5]。目前，對(duì)于微波催陳的研究主要集中在微波條件下黑米酒中酚類、黃酮類、理化特性等指標(biāo)的變化：Yuan等[6]用EPR研究微波誘導(dǎo)模型酒產(chǎn)生羥乙基自由基，從內(nèi)在機(jī)制闡述了微波催陳的原理；王婷婷等[7]研究了微波對(duì)酒中模式蛋白氧化特性的影響；候增超等[8]研究了微波對(duì)小分子酚酸和大分子化合物相互作用的影響；陳卓瑤等[4]研究了微波技術(shù)對(duì)黑米酒中主要活性成分、物化特性和活性的影響。

酚類物質(zhì)的組成和含量不僅影響黑米酒的顏色、香氣和口感等感官特性，還影響黑米酒的生理活性[9]。黑米酒的酸性特性主要由有機(jī)酸的種類、濃度及組成決定，進(jìn)而影響黑米酒的口感[10]。黑米酒的香氣主要由酯類物質(zhì)的濃度和組成來衡量，與黑米酒的品質(zhì)密切相關(guān)[3]。研究擬以黑米酒為研究對(duì)象，探究不同微波處理?xiàng)l件對(duì)黑米酒中主要酚類、有機(jī)酸類和酯類含量的影響，為將微波技術(shù)應(yīng)用于黑米酒并改善黑米酒感官品質(zhì)提供理論依據(jù)，以期解決黑米酒傳統(tǒng)陳釀技術(shù)存在的耗時(shí)長、成本高等弊端。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米酒：釀造年份為2019年，酒精含量為9%(體積分?jǐn)?shù))，陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司；

沒食子酸、原兒茶酸、咖啡酸和丁香酸：色譜純(≥98.00%)，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

乙酸、酒石酸、草酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸：分析純，中國食品藥品檢定研究院；

乙酸乙酯、戊酸乙酯、乳酸乙酯：分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司；

Folin-Ciocalteu試劑、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、無水乙醇、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、磷酸、甲酸：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

甲醇、乙腈：色譜純(≥98.00%)，美國默克公司。

1.2 儀器設(shè)備

NewClassic電子天平：ME104E型，上海梅特勒—托利多儀器有限公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV1800PC型，上海菁華科技儀器有限公司；

高效液相色譜：1260型，安捷倫科技有限公司；

微波合成儀：XH-MC-1型，北京祥鵠科技發(fā)展有限公司；

大扭矩調(diào)速型蠕動(dòng)泵：WT600S型，保定雷弗流體科技有限公司；

低溫冷卻液循環(huán)泵：DLSB-10L型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品微波處理過程 采用實(shí)驗(yàn)空自建的閉合式磁力攪拌控溫冷卻系統(tǒng)(CMCC-MI)[11]，將樣品(50 mL)置于CMCC-MI系統(tǒng)樣品瓶中，于不同微波條件下處理樣品，每組重復(fù)3次。處理?xiàng)l件：設(shè)定微波溫度40 ℃、時(shí)間3 min，在功率為100，200，300 W條件下處理；設(shè)定微波時(shí)間3 min、功率100 W，在微波溫度為30，40，50 ℃條件下處理；設(shè)定微波功率100 W、溫度40 ℃，在微波時(shí)間為1，3，6 min條件下處理。

1.3.2 酚類物質(zhì)含量測(cè)定

(1) 總酚含量測(cè)定：Folin-酚比色法[12]。

(2) 流動(dòng)相的制備：流動(dòng)相A為1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B為1%甲酸的甲醇溶液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣20 min后使用。

(3) 酚類標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取原兒茶酸(2.5 mg)、沒食子酸(25.0 mg)、丁香酸(5.4 mg)、咖啡酸(2.6 mg)，用甲醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，得原兒茶酸、沒食子酸、丁香酸、咖啡酸的質(zhì)量濃度分別為0.050，0.500，0.108，0.052 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅰ。

(4) 色譜條件：色譜柱為反相液相色譜柱(安捷倫ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL，流速1.0 mL/min；檢測(cè)波長280 nm，梯度洗脫條件： 0 min，100% A；3 min，98% A+2% B；18 min，90% A+10% B；28 min，80% A+20% B；43 min，70% A+30% B；63 min，30% A+70% B；64 min，0% A；69 min，0% A；74 min，98% A+2% B。

1.3.3 有機(jī)酸類含量測(cè)定

(1) 總酸含量測(cè)定:采用酸堿滴定法[13]，以酒石酸為當(dāng)量，計(jì)算總酸含量。

(2) 流動(dòng)相的制備：用H3PO4溶液將0.02 mol/L的NaH2PO4溶液的pH調(diào)至2.70，濾膜過濾并超聲脫氣后使用。

(3) 有機(jī)酸類標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精密稱取乙酸(0.88 mL)、酒石酸(40.0 mg)、檸檬酸(60.0 mg)、乳酸(0.16 mL)、草酸(1.2 mg)、蘋果酸(50.0 mg)標(biāo)準(zhǔn)品后混合，用0.02 mol/L的NaH2PO4(pH 2.70)定容至20 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，得乙酸(46.2 mg/mL)、酒石酸(2.0 mg/mL)、檸檬酸(3.0 mg/mL)、乳酸(9.6 mg/mL)、草酸(0.06 mg/mL)、蘋果酸(2.5 mg/mL)的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅱ。

(4) 色譜條件：色譜柱(TSKgel ODS-100V，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.02 mol/L NaH2PO4，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.6 mL/min，檢測(cè)波長220 nm。

1.3.4 酯類物質(zhì)含量測(cè)定

(1) 總酯含量測(cè)定：采用酸堿滴定法[14]，以乙酸乙酯為當(dāng)量，計(jì)算總酯含量。

(2) 流動(dòng)相的制備：精確稱取6.80 g KH2PO4，用純凈水溶解并定容至1 L，得0.05 mol/L KH2PO4的流動(dòng)相A；乙腈為流動(dòng)相B，濾膜過濾并超聲脫氣后使用。

(3) 酯類標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：在25 ℃條件下分別量取戊酸乙酯(ρ=0.875 g/mL)，乳酸乙酯(ρ=1.031 g/mL)和乙酸乙酯(ρ=0.902 g/mL)標(biāo)準(zhǔn)品0.229，0.485，0.554 mL，用乙腈定容至10 mL，所得質(zhì)量濃度分別為20，50，50 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅲ，避光置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

(4) 色譜條件：色譜柱為反相液相色譜柱(安捷倫ZORBAX SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：0.05 mol/L KH2PO4溶液；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流速1.0 mL/min；檢測(cè)器波長210 nm，采用等度洗脫程序(VKH2PO4∶V乙腈=92∶8)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取0.10，0.20，0.50，1.00，2.50，5.00 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅰ于容量瓶，用甲醇定容至10 mL；精密吸取0.20，0.40，0.50，1.60，3.20 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅱ于容量瓶，用0.02 mol/L的NaH2PO4溶液定容至20 mL；精密吸取0.50，1.00，2.00，4.00，8.00 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液Ⅲ于容量瓶，用0.05 mol/L 的NaH2PO4溶液定容至20 mL。上述溶液分別按相應(yīng)的色譜條件檢測(cè)，以樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，得到黑米酒中主要活性成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(見表1)，R2>0.99，說明黑米酒中的主要酚類、有機(jī)酸類和酯類化合物在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表1 13種標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍Table 1 Standard curve, correlation coefficient, linear range of 13 kinds of standards

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，使用SPSS 24.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異，P<0.01表示具有極顯著性差異，使用Origin 2018軟件進(jìn)行相關(guān)圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波處理對(duì)黑米酒酚類物質(zhì)的影響

黑米酒中總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=13.92X-1.74，R2=0.992 6。不同微波處理?xiàng)l件對(duì)黑米酒中酚類物質(zhì)含量的影響如圖1所示，黑米酒中含有較高濃度的酚類，其中原兒茶酸含量最高；經(jīng)過不同微波條件處理的黑米酒，總酚和咖啡酸含量呈下降趨勢(shì)，原兒茶酸、沒食子酸和丁香酸含量呈上升趨勢(shì)。酚類物質(zhì)是黑米酒的骨架物質(zhì)，參與形成濃郁的陳釀香氣，可以提高酒體的結(jié)構(gòu)感、抗氧化性和抗自由基能力等，但過多的酚類物質(zhì)會(huì)使黑米酒的苦澀味加重，嚴(yán)重影響黑米酒的色澤和感官質(zhì)量[15]。由圖1可知，隨著微波功率、溫度和時(shí)間的增加，微波處理后黑米酒中總酚含量與未處理的相比顯著下降(P<0.05)?？偡雍肯陆档脑蚩赡苁蔷企w中的介質(zhì)在微波場(chǎng)下相互摩擦，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量自由基[7]，導(dǎo)致酚類物質(zhì)發(fā)生氧化或降解反應(yīng)[11]，進(jìn)而導(dǎo)致總酚含量下降，這與自然陳釀過程中總酚含量變化趨勢(shì)一致[16-17]。

*與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)圖1 微波處理?xiàng)l件對(duì)黑米酒中酚類物質(zhì)含量的影響Figure 1 Effects of microwave treatment conditions on the content of phenols in black rice wine

原兒茶酸是澀味與苦味的主要來源，其含量影響酒的滋味和口感[18]。由圖1可知，黑米酒經(jīng)較高功率和較長時(shí)間微波處理后原兒茶酸含量明顯增加(P<0.05)，由于原兒茶酸是合成某些復(fù)雜類分子如花青素的前體，在較高功率和較長時(shí)間條件處理下可能加速了這些大分子的解聚反應(yīng)，導(dǎo)致原兒茶酸含量有所增高，從而改變了黑米酒的口感。

沒食子酸與黑米酒的品質(zhì)和口感密切相關(guān)[19]，其濃度、聚合度及化學(xué)結(jié)構(gòu)影響酒的澀味和苦味。由圖1可知，在300 W、40 ℃和3 min的微波條件下沒食子酸含量明顯增加(P<0.01)，說明在此微波處理?xiàng)l件下能達(dá)到較好的催陳效果，對(duì)黑米酒的口感起到關(guān)鍵作用。

黑米酒中含有多種抗氧化、消除自由基的花色苷單體，丁香酸作為輔色素可與花色苷單體結(jié)合產(chǎn)生輔色效應(yīng)，使酒色度更深、色澤更穩(wěn)定[20]。由圖1可知，與未處理的黑米酒相比，經(jīng)微波處理的丁香酸含量顯著增加(P<0.05)，可能是因?yàn)槲⒉▓?chǎng)下的丁香酸花色苷聚合物發(fā)生部分降解，從而提高了黑米酒中丁香酸的含量；隨著溫度和時(shí)間的逐漸增加，丁香酸含量趨于穩(wěn)定，說明丁香酸花色苷聚合物的降解速度和聚合速度基本一致。

咖啡酸是黑米酒中重要的酚類輔色素，可使花色苷聚合成穩(wěn)定的化合物，提高花色苷的穩(wěn)定性，從而影響黑米酒的色澤[21]。與未處理的黑米酒相比，經(jīng)微波處理后黑米酒中咖啡酸含量呈明顯下降趨勢(shì)(P<0.05)，可能是因?yàn)榭Х人崤c花色苷結(jié)合產(chǎn)生花色苷衍生物，從而提高花色苷的穩(wěn)定性；隨著微波功率、溫度、時(shí)間的升高，咖啡酸的質(zhì)量濃度逐漸趨于穩(wěn)定，可能是因?yàn)榭Х人岬纳煞磻?yīng)和咖啡酸的消耗反應(yīng)處于動(dòng)態(tài)平衡。由于咖啡酸輔色效果較好，在不同微波條件下咖啡酸含量的降低可以間接反映黑米酒的顏色趨于穩(wěn)定，從而說明微波技術(shù)有催陳黑米酒的作用。

2.2 微波處理對(duì)黑米酒有機(jī)酸類物質(zhì)的影響

有機(jī)酸是形成酒復(fù)合風(fēng)味的主要成分，賦予酒體豐滿度和酸爽感，與其他風(fēng)味物質(zhì)共同組成酒所特有的芳香，是酒體醇厚、優(yōu)雅等風(fēng)味形成的關(guān)鍵[22]。有機(jī)酸含量較少時(shí)酒味寡淡，可以使黑米酒變得舒適可口，若有機(jī)酸含量過高，酒味變得厚重粗糙，對(duì)喉部產(chǎn)生強(qiáng)烈的刺激性，因此有機(jī)酸的含量是評(píng)價(jià)酒體風(fēng)味的重要指標(biāo)之一[23]。微波處理后黑米酒中的總酸含量略低于未處理黑米酒總酸含量，可能是由于微波處理加快了黑米酒中的分子運(yùn)動(dòng)，黑米酒中某些揮發(fā)性有機(jī)酸揮發(fā)導(dǎo)致總酸濃度降低；也可能是黑米酒吸收微波能后，分子內(nèi)能增加，加速了酒體中的酯化反應(yīng)，在一定程度上加速了黑米酒的熟化。從總酸含量變化來看，在功率100 W、溫度30 ℃和較長時(shí)間微波處理?xiàng)l件下，總酸含量明顯降低(P<0.05)，因此，采用低功率、低溫和較長時(shí)間處理有利于黑米酒有機(jī)酸含量的控制。由圖2可知，經(jīng)微波處理后，黑米酒乙酸含量微弱上升；酒石酸、檸檬酸、乳酸和總酸含量呈下降趨勢(shì)；草酸、蘋果酸含量變化較小。

*與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)圖2 微波處理?xiàng)l件對(duì)黑米酒中有機(jī)酸類物質(zhì)含量的影響Figure 2 Effects of microwave treatment conditions on the content of organic acids in black rice wine

從乙酸含量變化可以看出(圖2)，微波處理組中乙酸含量高于未處理組的，可能是由于微波能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的自由基[6]加速了黑米酒中醇、醛、酸、酯之間的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致黑米酒乙酸含量升高。

酒石酸含量在100 W、30 ℃、3 min或者6 min微波條件下明顯降低(P<0.05)，可能是因?yàn)槲樟宋⒉芎蟮暮诿拙?，分子?nèi)能增加，導(dǎo)致較多酒石酸發(fā)生降解或以酒石酸鹽結(jié)晶析出。

在40 ℃或50 ℃下微波處理3 min或6 min后，檸檬酸的含量降低可能是由于微波場(chǎng)使黑米酒分子內(nèi)能增加，加速了檸檬酸的脫羧和酯化反應(yīng)；較高功率的微波場(chǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的自由基[6]，可能造成檸檬酸的分解速度大于合成速度。黑米酒經(jīng)6 min微波處理后檸檬酸含量極明顯降低(P<0.01)，說明長時(shí)間微波處理可以減少檸檬酸帶來的酸澀感，這與自然陳釀過程中檸檬酸的變化趨勢(shì)一致。

在50 ℃時(shí)乳酸含量顯著降低(P<0.05)，可能是由于較高溫度的微波處理誘導(dǎo)黑米酒產(chǎn)生更多的自由基加速了乳酸的酯化反應(yīng)，導(dǎo)致乳酸含量明顯降低，因此100 W、3 min、50 ℃微波條件有利于保持黑米酒的醇厚感。

微波處理后的黑米酒中草酸含量變化不明顯。隨著微波時(shí)間和溫度的增加蘋果酸含量呈現(xiàn)出先降低后增加的波動(dòng)，而微波功率的變化對(duì)蘋果酸含量影響較小。蘋果酸對(duì)黑米酒的酸味、穩(wěn)定性和品質(zhì)等方面有著很大影響，在陳釀過程中部分蘋果酸轉(zhuǎn)化成琥珀酸造成蘋果酸含量下降[24]。在100 W、40 ℃、短時(shí)間的微波處理?xiàng)l件下，蘋果酸的含量最低，此條件符合蘋果酸在陳釀過程中的含量變化趨勢(shì)。

2.3 微波處理對(duì)黑米酒酯類物質(zhì)的影響

在自然陳釀過程中，隨著酒體貯藏時(shí)間的延長，總酯含量呈上升趨勢(shì)[25]。由圖3可知，與未經(jīng)處理的黑米酒相比，微波處理后的黑米酒中總酯含量增加，并且隨著微波功率、溫度和時(shí)間的增加而逐步增加，可能是由于微波通過高頻電磁場(chǎng)使黑米酒中的極性分子和水高頻極化，使獨(dú)立的難溶分子基團(tuán)有機(jī)融合、相互滲透，加快了酒中化學(xué)反應(yīng)[26]。因此，微波處理可以增加黑米酒的香氣，使酒體更加濃郁。

*與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，**與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)圖3 微波處理?xiàng)l件對(duì)黑米酒中酯類物質(zhì)含量的影響Figure 3 Effects of microwave treatment conditions on the content of esters in black rice wine

黑米酒中酯類化合物能夠豐富黑米酒香氣，提高酒體品質(zhì)。由圖3可知，經(jīng)過微波處理后的黑米酒中戊酸乙酯、乙酸乙酯和總酯含量呈上升趨勢(shì)，乳酸乙酯含量呈下降趨勢(shì)。

經(jīng)微波處理后的黑米酒中的戊酸乙酯含量與未處理的相比極顯著增加(P<0.01)，說明微波處理可以加速戊酸乙酯的形成，有利于增加黑米酒的香氣。

隨著微波時(shí)間的延長，乙酸乙酯的含量極顯著增加(P<0.01)，可能是因?yàn)槲⒉ㄌ幚砑铀倭艘宜崤c乙醇的酯化反應(yīng)；低功率微波有利于乙酸乙酯的含量升高；隨著微波溫度的增加，乙酸乙酯含量逐漸上升，在40 ℃時(shí)乙酸乙酯含量升高至65.55%，但在50 ℃時(shí)乙酸乙酯含量低于40 ℃時(shí)的，可能是由于較高的溫度條件下降解作用大于合成作用，因此造成了乙酸乙酯的含量降低。工業(yè)生產(chǎn)過程中采用40 ℃、短時(shí)間和低功率的微波條件來促進(jìn)乙酸乙酯的形成，該條件也能夠更好地改善黑米酒的感官特性、促進(jìn)黑米酒的陳化。

微波處理時(shí)間和功率對(duì)乳酸乙酯含量的影響較??；乳酸乙酯的含量在不同的微波溫度條件下均低于未處理的，可能在處理過程中微波能量被黑米酒吸收，加速了黑米酒的乳酸乙酯的分解，當(dāng)微波溫度為30 ℃時(shí)，乳酸乙酯含量降低了35.65%。微波溫度為40 ℃時(shí)，乳酸乙酯略微升高。因此，采用微波溫度40 ℃、微波功率200 W有利于乳酸乙酯的形成。

3 結(jié)論

微波技術(shù)可以通過加速黑米酒活性成分的分解、氧化、聚合、酯化等反應(yīng)快速改變黑米酒中酚類、有機(jī)酸、酯類物質(zhì)以及相應(yīng)的13個(gè)單體化合物的含量，從而快速改變黑米酒的感官品質(zhì)。為了進(jìn)一步科學(xué)調(diào)控黑米酒催陳工藝后續(xù)需要對(duì)黑米酒理化特性的改變進(jìn)行研究。