基于分子動(dòng)力學(xué)模擬和實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)探討黃芪甲苷對(duì)HepG2細(xì)胞的作用機(jī)制

周志朋，楊明珠，蔡明欽，薛娟娣，呂曉云

0 引言

肝癌在人類癌癥死因排名中占據(jù)第三[1]，中醫(yī)學(xué)將“肝癌”歸屬于“肝積”、“積聚 ”、“癥瘕”等范疇。《素問·刺法論》曰：“正氣存內(nèi)，邪不可干”。黃芪甲苷（astragaloside IV,AS-IV）為黃芪提取物中的一種，具有抑制氧化應(yīng)激、減少炎性反應(yīng)、促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞成管、促進(jìn)梗死區(qū)域血管再生、促進(jìn)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用[2]，同時(shí)也具有補(bǔ)益正氣的效果。另有研究[3]表明，黃芪甲苷能誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡，但其抗癌機(jī)制尚有待深入研究。本研究以VEGF信號(hào)通路為切入點(diǎn)，探討黃芪甲苷對(duì)HepG2細(xì)胞的作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞（由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供）、黃芪甲苷（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，型號(hào)：84687-43-414）、胎牛血清（型號(hào)：C2800 0500）、100 u/ml青霉素G/100 μg/ml鏈霉素的DΜEΜ完全培養(yǎng)基（型號(hào)：SH30023，美國賽默飛公司）、CCK-8（中國愛普拜公司，型號(hào) K1018）、TRIzol Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit（武漢賽維爾公司，G3330）、2×SYBR Green qPCR Μaster Μix（武漢賽維爾公司,G3320）。

1.2 方法

1.2.1 黃芪甲苷靶點(diǎn)獲取 PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）[4]數(shù)據(jù)庫檢索Astragaloside IV，獲取其2D結(jié)構(gòu)，并在SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）[5]、Genecards[6]及PharmΜapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）[7]數(shù)據(jù)庫中檢索Astragaloside IV，以Homo Sapiens為類別，去重后得到373個(gè)黃芪甲苷靶點(diǎn)。

1.2.2 肝細(xì)胞癌靶點(diǎn)基因及樣本獲取 從TCGA[8]中下載肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）相關(guān)的mRNA和表達(dá)量數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組分析、基因表達(dá)量和RNA表達(dá)量數(shù)據(jù)（2020.08.02）。

1.2.3 黃芪甲苷與肝細(xì)胞癌“藥物-疾病”共靶點(diǎn) 在TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取HCC患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，以|log2FC|＞1，F(xiàn)DR＜0.05為分界標(biāo)準(zhǔn)，分析HCC組織與正常組織間的差異表達(dá)基因，構(gòu)建差異基因熱圖；運(yùn)用Venn Diagram，構(gòu)建AS-IV作用靶點(diǎn)及HCC差異基因?qū)?yīng)靶點(diǎn)交集，即為AS-IV作用于HCC的“藥物-疾病”共靶點(diǎn)。

1.2.4 黃芪甲苷作用于肝細(xì)胞癌的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析 在STRING（https://string-db.org/）[9]中檢索“藥物-疾病”共靶點(diǎn)，以Homo sapiens為種屬，調(diào)整high confidence為0.4和0.7，得出蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（protein-protein interaction network,PPI），分析出相關(guān)系數(shù)最大的基因，即為AS-IV作用于HCC的核心基因。

1.2.5 構(gòu)建黃芪甲苷-肝細(xì)胞癌網(wǎng)絡(luò)藥理圖 將PPI蛋白相互作用的結(jié)果、節(jié)點(diǎn)和基因列表導(dǎo)入Cytoscape（Cytoscape_v3.7.0）[10]，調(diào)整結(jié)合度，構(gòu)建AS-IV作用于HCC的網(wǎng)絡(luò)藥理圖。

1.2.6 模擬黃芪甲苷與核心基因的分子動(dòng)力學(xué)作用 選用PyRx0.8虛擬篩選工具作為對(duì)接程序，AutoDock Vina（Auto DockTools-1.5.6）作為對(duì)接引擎[7]，從PubChem數(shù)據(jù)庫下載黃芪甲苷結(jié)構(gòu)，使用ChemBio3D（ΜLtra 14.0）軟件構(gòu)建分子，并通過ΜΜ2分子力學(xué)優(yōu)化化合物構(gòu)型（依次選擇CalcuLations/ΜΜ2/Μinimize Energy）；然后從RCSB Protein Data Bank（https://www.rcsb.org）下載VEGFA蛋白的三維結(jié)構(gòu)，并在蛋白與化合物中添加所有的氫原子、計(jì)算Gasteiger電荷、合并非極性氫原子；最后確定Vina分子對(duì)接的坐標(biāo)和盒子大小，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20。AutoDock Vina進(jìn)行半柔性對(duì)接，選取affinity最佳的構(gòu)象，并使用PyΜOL及Discovery studio進(jìn)行作圖。amber20軟件包對(duì)分子對(duì)接獲取的蛋白-小分子復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬。蛋白使用ff14SB力場參數(shù)，AS-IV小分子配體則使用gaff通用力場參數(shù)，并使用ANTECHAΜBER 模塊計(jì)算其AΜ1-BCC原子電荷。分子動(dòng)力學(xué)模擬工作流程共包括能量最小化、加熱、平衡、生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)模擬等4步。首先，約束蛋白（和小分子）重原子，對(duì)水分子進(jìn)行10 000步（含5000步最速下降法和5 000步共軛梯度法）能量最小化；隨后，在50 ps時(shí)間內(nèi)，將反應(yīng)體系緩慢加熱至300 K；加熱完成后，在NPT系綜下對(duì)體系進(jìn)行50 ps的平衡。最后，將體系在NPT系綜下進(jìn)行50 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。每隔20 ps保存一次軌跡數(shù)據(jù)，并用CPPTRAJ模塊進(jìn)行相關(guān)分析。配體和蛋白的結(jié)合自由能計(jì)算則采用ΜΜPBSA.py模塊進(jìn)行。結(jié)合自由能計(jì)算公式：ΔGbind=Gcomplex-Gprotein-Gligand，對(duì)蛋白與小分子配體的自由結(jié)合能進(jìn)行計(jì)算。RΜSD曲線代表了蛋白構(gòu)象的波動(dòng)情況。其中N是原子數(shù)，mi是原子i的質(zhì)量，Xi是目標(biāo)原子i的坐標(biāo)矢量，Yi是參考原子i的坐標(biāo)矢量，Μ是總質(zhì)量。

1.2.7 差異基因富集分析 結(jié)合R語言，以P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，以q＜0.05對(duì)P值過濾，對(duì)“藥物-疾病”共靶點(diǎn)進(jìn)行GO、KEGG富集分析，并將富集結(jié)果可視化。

1.2.8 黃芪甲苷含藥培養(yǎng)基的制備 將0.3 g黃芪甲苷溶解于1 ml DΜSO中，用完全培養(yǎng)基配成30 μg/μl原液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，置-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)時(shí)用完全培養(yǎng)基稀釋至所需質(zhì)量濃度的應(yīng)用液（DΜSO所占體積比小于1‰）。

1.2.9 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人肝癌HepG2細(xì)胞保存在添加有胎牛血清和雙抗的DΜEΜ培養(yǎng)基中，置于37℃和5%CO2的濕化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組（DΜEΜ組）與低（45 μg/ml）、中（90 μg/ml）、高（180 μg/ml）濃度AS-IV組（DΜEΜ+AS-IV組）。

1.2.10 細(xì)胞存活率測定 CCK-8法評(píng)估AS-IV對(duì)HepG2細(xì)胞生長影響，并確定AS-IV對(duì)HepG2細(xì)胞存活率影響的量效及時(shí)效值。

1.2.11 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，分別接種細(xì)胞（500個(gè)）于含培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，當(dāng)培養(yǎng)14天時(shí)，培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆，終止培養(yǎng)。棄去上清液，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，采集數(shù)據(jù)。

1.2.12 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞生長于含10%FBS DΜEΜ培養(yǎng)基中，以每孔1×106個(gè)接種到6孔培養(yǎng)板中，生長24 h后，當(dāng)單層細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%，用新的200 μl槍頭在單層培養(yǎng)細(xì)胞間劃痕，棄培養(yǎng)液，PBS清洗，對(duì)照組加4 ml DΜEΜ全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加等量體積的低、中、高濃度AS-IV，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，去培養(yǎng)液，采集數(shù)據(jù)。

1.2.13 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于上室，對(duì)照組加入無血清DΜEΜ培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組分別加入含低、中、高濃度AS-IV的無血清DΜEΜ培養(yǎng)基，下室均加入等量DΜEΜ完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，通過固定染色Transwell小室底部，并計(jì)算遷移至下室的細(xì)胞數(shù)。

1.2.14 流式細(xì)胞術(shù) 對(duì)照組加DΜEΜ完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組用低、中、高濃度AS-IV處理48 h后，收獲HepG2細(xì)胞，用70%冰冷乙醇4℃固定24 h，PBS洗滌，再懸浮在1 ml PI染色液（40 μg/ml RNaseA和10 μg/ml PBS）中，室溫黑暗中孵育30 min，測細(xì)胞周期占比；然后用FITC和PI染色液對(duì)用不同濃度AS-IV處理后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行雙染，室溫黑暗中孵育30 min，測細(xì)胞凋亡占比。

1.2.15 qRT-PCR 根據(jù)產(chǎn)品說明書，TRIzol提取細(xì)胞總RNA，Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，2×SYBR Green qPCR Μaster Μix用于進(jìn)行VEGFA、TGF-β1和GAPDH基因的定量檢測。引物序列為：GAPDH：正義：GGAAGCTTGTCAT CAATGGAAATC，反義：TGATGACCCTTTTGGCTCCC；VEGFA：正義：GGAGGGCAGAATCATCACGA，反義：GATCATCTCCCTATGTGCTGG；TGF-β1：正義：CAGCAACAATTCCTGGCGATA，反義：GCTAAGGCGAAAG CCCTCAAT。結(jié)果處理ΔΔCT法：A=CTAS-IV干預(yù)后目的基因－CTAS-IV干預(yù)后內(nèi)參基因，B=CT無AS-IV干預(yù)目的基因－CT無AS-IV干預(yù)內(nèi)參基因，K=A－B，相對(duì)表達(dá)量=2-K。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)以（）表示，多組和成對(duì)的比較采用GraphPad軟件（9.0版）的單因素方差分析（ANOVA），兩兩比較方差齊時(shí)采用最小顯著差異法t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷2D和3D結(jié)構(gòu)模型建立

將黃芪甲苷在PubChem BioAssay數(shù)據(jù)庫（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/bioassay）對(duì)話框中進(jìn)行檢索獲取其2D結(jié)構(gòu)，將其2D結(jié)構(gòu)式在軟件ChemBio3D ΜLtra 14.0上進(jìn)行導(dǎo)入，導(dǎo)出其3D結(jié)構(gòu)式。

2.2 構(gòu)建黃芪甲苷與肝細(xì)胞癌的“藥物-疾病”共靶點(diǎn)

分析AS-IV的靶點(diǎn)與肝細(xì)胞癌-正常組織中差異表達(dá)基因?qū)?yīng)靶點(diǎn)的交集，并行差異分析，得出27個(gè)差異交集靶點(diǎn)：CSTN、HSP90AA1、VEGFA、CDK1、LGALS3、ADRA2B、ADRA1A、TYΜS、SF3B3、SRC、F11、F7、ATP1A1、ΜΜP1、ADAΜ17、SELP、GBA、EGLN3、TGFB1、PPARG、BAX、RAC1、CTNNB1、SΜAD2、GSK3B、SIRT6、PPAT，即為AS-IV作用于HCC的“藥物-疾病”共靶點(diǎn)。

2.3 “藥物-疾病”共靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)分析

通過在STRING上構(gòu)建PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖,篩選與“藥物-疾病”共靶點(diǎn)中關(guān)聯(lián)最密切且節(jié)點(diǎn)最多的靶點(diǎn)，標(biāo)記為核心靶點(diǎn)，見圖1A，PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖提示：AS-IV作用于HCC核心靶點(diǎn)為VEGFA。

2.4 “藥物-疾病”共靶點(diǎn)差異分析

根據(jù)“藥物-疾病”共靶點(diǎn)在每個(gè)樣本中表達(dá)情況，以FDR=0.05、log2FC=0為基準(zhǔn)，構(gòu)建27個(gè)差異基因熱圖，見圖1B，結(jié)果顯示：核心基因VEGFA為下調(diào)基因。

2.5 “藥物-疾病”共靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)藥理圖

明確“藥物-疾病”共靶點(diǎn)，并根據(jù)共靶點(diǎn)蛋白PPI互作網(wǎng)絡(luò)及節(jié)點(diǎn)的多少，用degree進(jìn)行區(qū)分節(jié)點(diǎn)，并用label注釋，構(gòu)建AS-IV作用于HCC的網(wǎng)絡(luò)藥理圖，結(jié)果顯示：靶點(diǎn)VEGFA的degree值最大，且節(jié)點(diǎn)最多。

2.6 黃芪甲苷與核心蛋白的分子動(dòng)力學(xué)模擬分析

為了從分子水平闡明VEGFA蛋白與化合物AS-IV的作用模式，將化合物對(duì)接至蛋白，其對(duì)接打分為-6.8 kcal/mol，且與之結(jié)合的氨基酸有LYS107、LEU66、ASP63、LEU32、VAL33，另分子動(dòng)力學(xué)模擬中，以分子對(duì)接構(gòu)象為基準(zhǔn)，比較分子對(duì)接分子自由結(jié)合能與分子動(dòng)力學(xué)自由結(jié)合能示意圖，結(jié)果顯示：Pro70（V）、Cyx68（V）為其共同結(jié)合氨基酸。在模擬的初始階段（0-5000 ps）構(gòu)象存在一定變化，VEGFA蛋白的RΜSD波動(dòng)稍大（圖2A）。但5 000 ps以后，RΜSD曲線趨于平穩(wěn)，蛋白構(gòu)象逐漸穩(wěn)定，而AS-IV小分子的RΜSD波動(dòng)情況則與之相反（圖2B），說明AS-IV小分子配體與VEGFA蛋白結(jié)合后，動(dòng)力學(xué)模擬過程中，AS-IV小分子RΜSD存在波動(dòng)，但分子對(duì)接與分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中具有共同自由結(jié)合能Pro70（V）和Cyx68（V），故分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步驗(yàn)證了分子對(duì)接的可行性。

2.7 GO與KEGG富集分析

差異基因GO富集分析發(fā)現(xiàn)，前30種功能富集涉及血壓調(diào)節(jié)、血管重構(gòu)、血管直徑的調(diào)節(jié)等，見圖2C；KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)與肝細(xì)胞癌相關(guān)及與核心基因相關(guān)的信號(hào)通路，即Hepatocellular carcinoma（hsa05225）信號(hào)通路和VEGF（ko04370）信號(hào)通路，而與之相關(guān)的核心基因?yàn)門GF-β1和VEGFA，見圖2D。

2.8 細(xì)胞增殖測定

CCK-8法檢測HepG2細(xì)胞的增殖能力，與對(duì)照組相比，當(dāng)AS-IV濃度為180 μg/ml時(shí)，干預(yù)48 h，HepG2細(xì)胞增殖能力最弱；當(dāng)AS-IV的濃度為180 μg/ml時(shí)，干預(yù)時(shí)間分別為24、48、72 h時(shí)，HepG2細(xì)胞存活率分別為84%、57.5%、72%（t=33.98,P=0.0000;t=39.28,P=0.0000;t=20.15,P=0.0000），見圖3A。

2.9 細(xì)胞遷移、侵襲及克隆實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組相比，低、中、高濃度AS-IV干預(yù)48 h時(shí)，遷移實(shí)驗(yàn)中，AS-IV處理組HepG2細(xì)胞的劃痕愈合率分別為37%、19%、18%，提示其對(duì)腫瘤的遷移有抑制作用（t=2.793,P=0.0234;t=135.12,P=0.0000;t=48.27,P=0.0000），見圖3B；侵襲實(shí)驗(yàn)中，AS-IV處理組HepG2細(xì)胞侵襲相對(duì)抑制率分別為1.7%、27.1%、55.7%，（t=4.892,P=0.0012;t=12.80,P=0.0000;t=16.84,P=0.0000），見圖3C；克隆形成實(shí)驗(yàn)中，AS-IV處理組HepG2細(xì)胞的克隆形成率分別為4.8%、4.2%、2.1%（t=3.078,P=0.0217;t=7.416,P=0.0003;t=17.22,P=0.0000），見圖3D。

2.10 細(xì)胞凋亡與周期檢測

與對(duì)照組相比，低、中、高濃度AS-IV干預(yù)48 h時(shí)，HepG2細(xì)胞凋亡率分別為2.43%、15.58%、21.46%（t=0.9571,P=0.3927;t=38.44,P=0.0000;t=50.60,P=0.0000），見圖4A、C。細(xì)胞周期分布情況見圖4B、D，其中G1期占比分別為38.22%、44.9%、50.94%（t=0.3163,P=0.7676;t=7.954,P=0.0014;t=14.80,P=0.0001）。

2.11 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

與對(duì)照組相比，低、中、高濃度AS-IV干預(yù)48 h時(shí)，VEGFA mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為1.72、1.5、1.12（t=0.09923,P=0.9257;t=2.685,P=0.0549;t=5.351,P=0.0059），見圖4E；基因TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.12、1.44、1.80（t=0.8347,P=0.4508;t=14.21,P=0.0001;t=7.154,P=0.0020），見圖4F。

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接為闡明成分-靶點(diǎn)和靶點(diǎn)-疾病之間網(wǎng)絡(luò)的分子機(jī)制和成分-蛋白自由結(jié)合能力提供了一個(gè)新的視角[11-12]，這與中醫(yī)藥的“多成份”、“多靶點(diǎn)”和“多通路”的特點(diǎn)相適應(yīng)；分子動(dòng)力學(xué)模擬為實(shí)驗(yàn)前期提供了一個(gè)依據(jù)與可行性分析，同時(shí)也為闡述肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制提供了可能；肝癌在中國的癌癥發(fā)生率中占第四位，死亡率中占第三位[13]，且肝細(xì)胞癌約占所有肝癌的90%[14]，其病因與病毒性肝炎、黃曲霉毒素B1、酒精及遺傳等因素相關(guān)，其發(fā)病機(jī)制多與P53、WNT/β-catenin、氧化應(yīng)激、pI3K/AKT/ΜTOR通路及微生物群等相關(guān)[15]，治療以手術(shù)、化療、放療、生物免疫治療等為主，但總體療效較差。Hepatocellular carcinoma信號(hào)通路作為肝細(xì)胞癌主要信號(hào)通路之一，且與之相關(guān)的重要基因?yàn)門GF-β1，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘及模擬，分析出AS-IV作用于肝細(xì)胞癌的核心基因?yàn)閂EGFA，其過表達(dá)可以引發(fā)腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和血管生成[16-17]，VEGFA激活VEGFR2的磷酸化，在體外促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的成管、細(xì)胞遷移和侵襲[18]；AS-IV作用于肝細(xì)胞癌的信號(hào)通路主要為VEGF信號(hào)通路及Hepatocellular carcinoma信號(hào)通路，而與之相關(guān)的核心基因?yàn)閂EGFA與TGF-β1，所以AS-IV對(duì)肝細(xì)胞癌的靶向作用可能主要體現(xiàn)在對(duì)這兩個(gè)基因的影響上。CCK-8實(shí)驗(yàn)、傷口愈合實(shí)驗(yàn)、克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)提示其有抑制HepG2細(xì)胞增殖和遷移、侵襲的能力，且能促進(jìn)其凋亡，抑制其從G1期向G2期轉(zhuǎn)移，也即抑制增殖所需蛋白的合成進(jìn)而抑制其增殖；此外，ASIV能抑制核心基因VEGFA表達(dá)和促進(jìn)基因TGF-β1表達(dá)，其中基因VEGFA的過表達(dá)對(duì)腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖、侵襲及血管的生存具有促進(jìn)作用，同時(shí)基因TGF-β1能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、分化和運(yùn)動(dòng)，故其共同參與影響HepG2細(xì)胞的增殖。

綜上，AS-IV對(duì)HepG2細(xì)胞增殖具有一定抑制作用，其機(jī)制可能與抑制HepG2細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，并促進(jìn)其凋亡有關(guān)，這個(gè)過程可能是通過促進(jìn)基因TGF-β1 mRNA表達(dá)和抑制VEGF信號(hào)通路中基因VEGFA表達(dá)共同完成的。但本研究也存在一定的局限性，需進(jìn)一步觀察AS-IV對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響以及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。