HPLC 法測(cè)定通氣丸中3 種有效成份的含量

韓吳琦，方慧祥，呂晉*，黃永麗

1 河南省開封市食品藥品檢驗(yàn)所，開封 475000；2 云南省曲靖市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，曲靖 655000；3 河南大學(xué)淮河臨床學(xué)院，開封 475000

通氣丸是由青皮（醋炙）、陳皮、蒲公英、連翹、木香、甘草和乳香（麩炒）共7 味中藥材組成，具有益氣養(yǎng)血、行氣化瘀的功效［1］，用于產(chǎn)后氣血不足、虛中夾瘀、寒熱錯(cuò)雜的脅腹脹痛、腹痛、頭身疼痛、惡露不絕、血暈昏迷、大便秘結(jié)、無乳等癥。方中青皮疏肝破氣，消積化滯；陳皮理氣健脾，燥濕化痰；連翹清熱解毒，消腫散結(jié)，疏散風(fēng)熱［2］。該處方現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定時(shí)間早，且僅有鑒別項(xiàng)而無其他測(cè)定指標(biāo)，不能客觀全面反映通氣丸的質(zhì)量。本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定了通氣丸中連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷的含量，以期為通氣丸的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AD 島津液相色譜儀（SIL-20A 自動(dòng)進(jìn)樣器、LC-20AT 泵、SPD-M20A230V 光電二極管陣列紫外可見光檢測(cè)器、CTO-20A 柱溫箱、DGU-20A5R 脫氣機(jī)、LCsolution 色譜工作站，日本島津制作所）；MS205DU 型電子天平（梅特勒—托利多公司）。

1.2 試藥

連翹酯苷A（批號(hào)：111810-201707，含量97.2%）、蕓香柚皮苷（批號(hào)：BW5225-2017030）、橙皮苷（批號(hào)：110721-201818，含量96.2%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；通氣丸（河南泰豐生物科技有限公司，規(guī)格：每袋裝9g，批號(hào)：20190301、201903031、20200301、20200302、20200303）；甲醇（色譜純，德國(guó)默克公司）；磷酸（分析純，西亞化工試劑有限公司）；水為二次蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸溶液，比例為35∶65；檢測(cè)波長(zhǎng)為283nm；流速為1.0ml/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為10μl。

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液的制備

取通氣丸適量，研細(xì)，取約0.4g，精密稱定后，轉(zhuǎn)移到帶塞的錐形瓶中。精密加入50ml 甲醇，稱定重量，超聲處理40min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷對(duì)照品適量，加甲醇制成含連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷分別為71.79、41.28、308.85μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備

按通氣丸的處方和制法分別制成缺連翹的陰性樣品和缺青皮、陳皮的陰性樣品，再按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，以混合對(duì)照溶液的色譜圖為參考，陰性對(duì)照品的色譜圖在對(duì)應(yīng)位置無相應(yīng)色譜峰，供試品溶液的色譜圖在對(duì)應(yīng)位置有相應(yīng)色譜峰，且相鄰色譜峰均能達(dá)到有效分離，其他成份對(duì)待測(cè)成份均無干擾。

圖1 混合對(duì)照品（A）、供試品（B）、缺連翹陰性樣品（C）和缺青皮、陳皮陰性樣品（D）的HPLC 圖

2.4 線性關(guān)系

取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，用0.45μm的微孔濾膜濾過。分別精密吸取2、4、6、8、10、20μl 濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。3 種成份在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，詳見表1。

表1 3 種成份線性關(guān)系

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10μl，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為1.53%、1.74%、1.50%。表明本方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下的供試品溶液，分別在2、4、8、16、24、48h 進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下的色譜條件測(cè)定峰面積。測(cè)得連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD 分別為0.28%、0.32%、0.15%。表明樣品溶液在48h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一樣品（批號(hào)：201903031）6 份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。測(cè)得樣品中連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷的平均含量分別為2.8537、2.4894、7.1189mg/g，RSD 分別為0.65%、0.48%和0.52%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號(hào)：201903031）6 份，每份約0.2g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中。分別精密加入連翹酯苷A、蕓香柚皮苷、橙皮苷對(duì)照品0.4307、0.2477、1.8531mg，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，以“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算回收率，其結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測(cè)定

取5 批樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，在“2.1”色譜條件下測(cè)定，以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見表3。

表3 通氣丸中3 種成份的含量測(cè)定結(jié)果 mg/g

3 討論

3.1 測(cè)定指標(biāo)的選擇

通氣丸中，青皮、陳皮為君藥，蒲公英為臣藥，連翹、木香、乳香為佐藥，甘草為使藥。君藥主要用于治療產(chǎn)后因氣血不足、虛中夾瘀、寒熱錯(cuò)雜造成的脅腹脹痛、腹痛、頭身疼痛等；佐藥連翹主要佐助君藥發(fā)揮治療作用和治療次要兼證［3］。青皮（醋炙）味苦、辛，溫，入肝經(jīng)，可疏肝破氣；陳皮味苦、辛，溫，歸肺、脾經(jīng)，可理氣調(diào)中。二者主要活性成份分別為橙皮苷和蕓香柚皮苷［4］；佐藥連翹中的主要活性成份為連翹酯苷A。橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力、防輻射、保護(hù)心血管系統(tǒng)等［5］藥理活性；蕓香柚皮苷和橙皮苷配伍給藥可明顯促進(jìn)正常小鼠的小腸推進(jìn)［6］；連翹酯苷A 可抑制乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）活性，從而減少乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）的水解而使其堆積，發(fā)揮擬膽堿作用［7-8］。ACh 為膽堿能興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，能使胃腸平滑肌收縮張力和振幅升高［9］。三者均可促進(jìn)胃腸推進(jìn)收縮和產(chǎn)后排氣，因此本研究選取橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 作為通氣丸的質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

在200~400nm 范圍內(nèi)對(duì)混合對(duì)照品溶液進(jìn)行紫外掃描。結(jié)果表明，橙皮苷、蕓香柚皮苷、連翹酯苷A 分別在283.6、282.4、291.0nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，參照2020 年版《中國(guó)藥典》［2］及相關(guān)文獻(xiàn)［10-12］，本研究選擇283nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的選擇

基于橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 的理化性質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)分別以50%、75%、100%甲醇為溶劑進(jìn)行提取，考察不同時(shí)間（30、45、60min）和不同方式（超聲、回流）處理樣品后對(duì)3 種成份含量的影響［10-12］。結(jié)果表明，以純甲醇為提取溶劑時(shí)，超聲45min 后提取效果最佳，且耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)單、便捷。

3.4 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)考察了不同比例的甲醇-乙腈-水、甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動(dòng)相系統(tǒng)［13］，并采取等度洗脫、梯度洗脫進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，以甲醇-0.1%磷酸溶液（35∶65）為流動(dòng)相的色譜圖基線平穩(wěn)，各組份峰形和分離效果均良好，因此確定其為流動(dòng)相。

3.5 含量測(cè)定結(jié)果分析

不同批次通氣丸中3 種成份的含量存在一定差異，這可能與處方中各組份的產(chǎn)地、采收季節(jié)、炮制方法、提取方法以及制劑的生產(chǎn)過程等多種因素有關(guān)。為了達(dá)到中藥復(fù)方制劑質(zhì)量的一致性，建議藥品生產(chǎn)企業(yè)除了控制制劑的生產(chǎn)過程外，還要加強(qiáng)把控藥材的來源、種植方式、采收、加工與炮制等環(huán)節(jié)，保證入藥品種的質(zhì)量。

通氣丸的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚未規(guī)定處方中各組份含量，難以體現(xiàn)樣品中有效成份的整體變化情況，也難以保證中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效傳遞。多指標(biāo)成份含量測(cè)定的控制模式可實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)成份的同時(shí)把關(guān)和對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的精確控制，能有效反映中藥制劑的有效性和穩(wěn)定性?；诖?，本研究建立的方法可同時(shí)測(cè)定通氣丸中3 種活性成份的含量，對(duì)通氣丸生產(chǎn)工藝的規(guī)范、優(yōu)化和質(zhì)量控制有一定指導(dǎo)作用，可作為其質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效方法。

綜上，本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高，可對(duì)通氣丸中橙皮苷、蕓香柚皮苷和連翹酯苷A 進(jìn)行定量測(cè)定，為完善通氣丸的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了一定的參考。