長鏈非編碼RNA LINC00467在卵巢癌的表達(dá)及其臨床意義

李劍琦 生秀杰

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院婦科，廣東省產(chǎn)科重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東省普通高校生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗室（廣州 510150）

長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類由長度大于200個核苷酸組成的RNA分子，其中大多數(shù)不翻譯成蛋白質(zhì)，而是以RNA 的形式發(fā)揮各種生物學(xué)功能［1］。近年來，越來越多的研究［2-5］提示，LncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達(dá)，并參與調(diào)控多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的信號通路，從而改變腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，包括細(xì)胞分化、增殖、凋亡、自噬、侵襲和遷移等等。大量研究［6-9］表明，LncRNA 在卵巢癌的發(fā)生、生長、代謝、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多個生物學(xué)過程中均發(fā)揮著重要作用。本課題組在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，5-氮雜-2-脫氧胞苷可以逆轉(zhuǎn)MEG3基因的甲基化從而增加LncRNA-MEG3 的表達(dá)，LncRNA-MEG3 通過調(diào)控P53 和Rb1 起到抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)凋亡的作用［10-11］。

LINC00467 是一種最近鑒定出的長鏈非編碼RNA，既往研究［12-19］表明，其在結(jié)腸癌、肝癌、肺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤、骨肉瘤以及頭頸部鱗癌等腫瘤中的表達(dá)均會出現(xiàn)失調(diào)，從而發(fā)揮出不同的腫瘤生物學(xué)效應(yīng)。例如，在結(jié)腸癌中，LINC00467的表達(dá)量是升高的，通過靶向細(xì)胞周期（Cyclin D1、Cyclin A1、CDK2、CDK4 等）以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Ecadherin、N-cadherin）相關(guān)蛋白，從而發(fā)揮出癌基因的作用［14］。近年來越來越多的證據(jù)［20］表明，LncRNA可以作為競爭性內(nèi)源RNA 在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮出癌基因或者抑癌基因的作用。既往研究［21］已經(jīng)證實(shí)，LncRNA中富含微小RNA（micro RNA，miRNA）反應(yīng)元件（MRE），并且可以充當(dāng)miRNA 海綿。LncRNA 能夠通過海綿化miRNA，將其從下游靶基因mRNA 的結(jié)合位點(diǎn)釋放，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。前期的研究中，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC00467 中包含miR-302a-3p 的結(jié)合位點(diǎn)。

本研究初步探討卵巢癌LINC00467 的表達(dá)情況及其與卵巢癌的臨床病理特征的關(guān)系，并進(jìn)一步探究其在卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性及其可能的作用機(jī)制，探討LINC00467 是否可能通過調(diào)控miR-302a-3p 而起到抑癌基因的作用，為尋找卵巢癌的早期診斷的標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和卵巢癌組織的獲取6 種卵巢癌細(xì)胞系（OVCAR-3、SKOV3、A2780、CAOV3、IGROV1和ES-2）和人正常卵巢上皮細(xì)胞系（HOSEpiC）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫（中國上海）。所有細(xì)胞均使用Dulbecco 改良Eagle 培養(yǎng)基（DMEM）（Corning，Inc.）在37 ℃和5% CO2下培養(yǎng)，該培養(yǎng)基含有10% 胎牛血清（FBS，Corning，Inc.）和1%青霉素-鏈霉素。廣州醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院2014-2016年共收集了66 例卵巢癌組織（OC，設(shè)為卵巢癌組織組）及66 例因良性病變行切除的正常卵巢組織（設(shè)為正常組織組），根據(jù)卵巢癌組織中LINC00467 的表達(dá)情況從高到低排序，前33例設(shè)為高表達(dá)組（n=33），后33 例設(shè)為低表達(dá)組（n=33）；上述卵巢癌組織和正常卵巢組織的收集經(jīng)過患者知情同意后獲取，知情同意符合赫爾辛基宣言。本研究經(jīng)廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染LINC00467 短發(fā)夾RNA（shRNA）（sh-LINC00467）、陰性對照shRNA（sh-NC）設(shè)計、miR-302a-5p mimics 和miR-302a-5p inhibitor 及其陰性對照（miR-mimics NC、miR-inihibitor NC）設(shè)計從廣州銳博生物技術(shù)有限公司購買。在處理前1 d將4 × 105細(xì)胞接種到60 mm 平板中。在操作當(dāng)天，根據(jù)說明書建議的量將20 nmol/L 轉(zhuǎn)染溶液與HiPerFect 和無血清培養(yǎng)基混合，以產(chǎn)生最終體積100 μL 的轉(zhuǎn)染試劑混合物。將混合物溶液孵育15 min 形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將100 μL 的溶液逐滴滴入細(xì)胞中，并將混合物置于培養(yǎng)箱中，使用Lipofectamine 3000 試劑（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）在37 ℃下按照制造商說明將上述試劑轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后48 h 收集細(xì)胞以備進(jìn)一步使用。轉(zhuǎn)染基因序列如下：sh-LINC00467#1，5′-CCG GGG TTT AAT AGA CAT GGA TAC TCG AGT ATC CAT GTC TAT TAA ACC TTT TTG-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACG GTT TAA TAG ACA TGG ATA CTC GAG TAT CCA TGT CTA TTA AAC C-3′；sh-LINC00467#2，5′-CCG GGA AGA AGA GAA GAG AGA AAC TCG AGT TTC TCT CTT CTC TTC TTC TTT TTG-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACG AAG AAG AGA AGA GAG AAA CTC GAG TTT CTC TCT TCT CTT CTT C-3′；sh-NC，5′-CCG GCA ACA AGA TGA AGA GCA CCA ACT CGA GTT GGT GCT CTT CAT CTT GTT GTT TTT G-3′ and 5′-AAT TCA AAA ACC AAC AAG ATG AAG AGC ACC AAC TCG AGT TGG TGC TCT TCA TCT TGT TG-3；miR-302a-5p mimics，5′-UAA GUG CUU CCA UGU UUU GGU GA-3′；miR-mimics NC，5′-CAG UAC UUU UGU GUA GUA CAA-3′；miR-302a-5p inhibitor，5′-AUU CAC GAA GGU ACA AAA CCA CU-3′；miRinihibitor NC，5′-CGA ACG UGU CAC GUT T-3′。

1.3 CCK-8 實(shí)驗和集落形成實(shí)驗使用細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8，Dojindo日本）和集落形成試驗評估細(xì)胞增殖能力。將OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞接種在96 孔板中（每孔2×103個細(xì)胞）。將細(xì)胞在37 ℃下培養(yǎng)24、48 和72 h，將CCK-8 溶液（10 μL）添加到96孔板的培養(yǎng)基中。然后將混合物在37 ℃孵育1.5 h，并使用分光光度計（BioTek Instruments，Inc，美國）測量450 nm 處的吸光度（OD）。對于集落形成實(shí)驗，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞接種到6 孔板中，并在37 ℃和5%CO2下孵育14 d。隨后，細(xì)胞集落在磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中洗滌3 次，用4%多聚甲醛固定，并在室溫下用0.1% 結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich；Merck KGaA）染色30 min。在顯微鏡（Leica Microsystems，德國）下計數(shù)菌落數(shù)。

1.4 Transwell 遷移和侵襲測定對于細(xì)胞遷移，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，消化細(xì)胞，將OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞重新懸浮在不含F(xiàn)BS 的DMEM 中，取細(xì)胞懸液100 μL 加入Transwell 小室，將小室架在24 孔板上，在24 孔板下室一般加入600 μL 的培養(yǎng)基。對于細(xì)胞侵襲測定，將OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞重懸于不含F(xiàn)BS 的DMEM 中，隨后加入覆蓋有Matrigel（Corning Inc.）的上室。在這兩種測定中，24 孔板的下腔室充滿了含有10%FBS 的DMEM。在37 ℃下孵育36 h 后，將Transwell 插入物用PBS 洗滌3 次，用甲醇固定，并在室溫下用結(jié)晶紫（Sigma-Aldrich，美國）染色30 min。在光學(xué)顯微鏡（Nikon，Tokyo，Japan）下計數(shù)侵襲細(xì)胞的數(shù)量。

1.5 定量實(shí)時PCR（qPCR）檢測使用Trizol 試劑（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.美國）從冷凍的OC 組織、正常卵巢組織和卵巢癌細(xì)胞系中提取總RNA，并使用Revert Aid First-Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific，Inc.美國）逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA。使用SYBR Premix Ex Taq II Kit（TaKaRa，中國）進(jìn)行qPCR 檢測，測定LINC00467和miR-302a-3p 的表達(dá)水平。熱循環(huán)程序包括在94 ℃下保持2 min，然后在94 ℃下30 s、56 ℃下30 s和72 ℃下60 s進(jìn)行30個循環(huán)。在本研究中，GAPDH用作內(nèi)源性對照。使用2-ΔΔCq方法計算相對mRNA表達(dá)。每個樣品一式三份進(jìn)行分析，LINC00467 引物Forward 5′-GCG TAG GCC GGA CAT TTC TA，Reverse 5′-CCT GCC ATG TTG GAA ACT GC；miR-302a-3p 引物Forward 5′- TAA GTG CTT CCA TGT TT，Reverse 5′-TGG TGT CGT GGA GTC G；GAPDH引物Forward 5′-GCA ACT AGG ATG GTG TGG CT，Reverse 5′-TCC CAT TCC CCA GCT CTC ATA。

1.6 雙熒光素酶報告基因測定將含有全結(jié)合序列的LINC00467 和含有野生型（wt）和突變型（mut）miR-302a-3p 分別克隆到Promega 公司提供的psi-CHECK2 載體中，以生成wt 或mut 質(zhì)粒，然后，使用Lipofectamine 3000（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）轉(zhuǎn)染到OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染36 h 后，根據(jù)制造商的說明書步驟進(jìn)行雙熒光素酶報告基因檢測（Promega 公司）以檢測相對熒光素酶信號。在分析之前，首先將熒光素酶的活性標(biāo)準(zhǔn)化為來自相同細(xì)胞的海腎熒光素酶的活性。

1.7 生物信息學(xué)分析利用基于癌癥基因組圖譜（TCGA）的基因表達(dá)譜交互分析數(shù)據(jù)庫（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/）評估LINC00467 在OC中的表達(dá)水平；通過Starbase 數(shù)據(jù)庫（https：//starbase.sysu.edu.cn）評估LINC00467 與miR-302a-3p 的結(jié)合位點(diǎn)。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 17.0軟件（SPSS，Inc.）和GraphPad Prism 9.0軟件（GraphPad Software，Inc.）進(jìn)行統(tǒng)計，計量資料使用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用Student′st檢驗分析；計數(shù)資料比較用χ2檢驗；相關(guān)性分析用Pearson 相關(guān)性分析；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00467 在卵巢癌組織（OC）和卵巢癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)從GEPIA 下載的表達(dá)譜結(jié)果提示卵巢癌組織（OC）LINC00467 表達(dá)明顯高于對照組（圖1A）。進(jìn)一步采用qPCR 檢測66 例OC 組織及其66例正常卵巢組織中的LINC00467表達(dá)情況，與66 例正常卵巢組織相比，OC 組織中LINC00467的表達(dá)明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1B）。LINC00467 表達(dá)與臨床特征（包括組織學(xué)類型、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO 分期）的關(guān)系見表1，結(jié)果顯示LINC00467 高表達(dá)組和低表達(dá)組病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO 分期差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。卵巢癌患者總生存期的分析結(jié)果表明低表達(dá)LINC00467 的OC 患者總生存期優(yōu)于高表達(dá)LINC00467 的OC 患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1C）。此外，本研究檢測了6 種卵巢癌細(xì)胞系（OVCAR-3、SKOV3、A2780、CAOV3、IGROV1和ES-2）和人卵巢上皮細(xì)胞系（HOSEpiC）中LINC00467的表達(dá)水平，卵巢癌細(xì)胞系的LINC00467表達(dá)水平顯著高于人卵巢上皮細(xì)胞系（圖1D）。由于在OC 細(xì)胞系中OVCAR-3 和SKOV3 兩株細(xì)胞系LINC00467 表達(dá)水平最高，因此將這兩株細(xì)胞系用于下一步研究。

圖1 卵巢癌TCGA 隊列中、卵巢癌組織和正常卵巢組織、卵巢癌細(xì)胞系和正常卵巢上皮細(xì)胞LINC00467A 表達(dá)水平Fig.1 LINC00467 is upregulated in OC tissue samples and cell lines，and TCGA

2.2 沉默LINC00467 抑制OVCAR-3 和SKOV3細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲能力通過轉(zhuǎn)染sh-LINC00467#1 和sh-LINC00467#2 使OVCAR-3 和SKOV3細(xì)胞系中的LINC00467沉默。與sh-NC組對比，sh-LINC00467 轉(zhuǎn)染OVCAR-3 和SKOV3 兩種細(xì)胞系后LINC00467 的表達(dá)均顯著下調(diào)（圖2A）。通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，與sh-NC組對比，sh-LINC00467組OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞的增殖能力逐漸降低（圖2B）。再次，sh-LINC00467 轉(zhuǎn)染的OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞中，集落形成試驗提示集落數(shù)量顯著減少（圖2C）。同時，Transwell 檢測發(fā)現(xiàn)，與sh-NC 組比較，sh-LINC00467 組的OVCAR-3 和SKOV3 細(xì)胞的遷移和侵襲能力被顯著抑制（圖2D-E）。

圖2 沉默LINC00467 后可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞惡性生物學(xué)表型Fig.2 Inhibition of LINC00467 suppresses the abilities of proliferation，migration，and invasion in OC OVCAR-3 and SKOV3 cell lines

2.3 LINC00467 可能通過調(diào)控miR-302a-3p 發(fā)揮促癌作用進(jìn)一步通過生物信息學(xué)分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，LINC00467中包含miR-302a-3p的結(jié)合位點(diǎn)（圖3A）。通過qPCR 檢測66 例OC 組織及其66 例正常卵巢組織中的miR-302a-3p 表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR-302a-3p的表達(dá)量明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3B），與LINC00467 表達(dá)恰好相反，兩者呈現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系（R2=0.381 5，P＜0.01，圖3C）。進(jìn)一步通過熒光素酶報告實(shí)驗驗證了LINC00467 與miR-302a-3p 之間的直接結(jié)合關(guān)系（圖3A）。同時，發(fā)現(xiàn)OVCAR-3 和SKOV3 兩種卵巢癌細(xì)胞系中敲低LINC00467 后，可以顯著升高miR-302a-3p 的表達(dá)水平，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖3D）。

圖3 LINC00467 靶向調(diào)控miR-302a-3pFig.3 LINC00467 targets miR-302a-3p in OC cells

3 討論

卵巢癌是女性腫瘤中第七大常見的腫瘤，僅次于宮頸癌，每年約有152 000 死亡病例，給全球女性的健康造成了嚴(yán)重的威脅［22］。在過去30年中，得益于腫瘤的治療手段和篩查方法的飛速發(fā)展，腫瘤的五年生存率總體上提高了20%，乳腺癌的五年生存率可達(dá)85%左右［23］。然而，卵巢癌的診治水平進(jìn)步有限，即使在歐美等醫(yī)療資源相對豐富的國家，幾十年來卵巢癌五年生存率僅僅維持在47%的水平［24］。手術(shù)切除是卵巢癌唯一治愈性治療的手段，其治療效果依賴于分期和組織學(xué)類型［25-26］。據(jù)既往研究，早期卵巢癌，即使伴有侵襲性組織亞型，其手術(shù)切除治愈率可高達(dá)90%［25］。但絕大多數(shù)卵巢癌患者在疾病的進(jìn)展期才被診斷，失去了進(jìn)行治愈性手術(shù)切除的機(jī)會，導(dǎo)致卵巢癌的病死率與發(fā)病率之比超過0.6；尤其是進(jìn)展到Ⅲ/Ⅳ期才被診斷的卵巢癌，其病死率甚至超過75%。對于進(jìn)展期卵巢癌的治療，目前的治療仍是基于鉑類或紫杉醇的聯(lián)合治療［27］。這些治療方案的使用顯著改善了進(jìn)展期卵巢癌患者的預(yù)后。上皮性卵巢癌患者對初始化療反應(yīng)非常好，大約80%的患者對此有很好的反應(yīng)，但是長期的隨訪結(jié)果提示其中許多患者都會復(fù)發(fā)［26］。因此，深入探究卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)更加有效的早期診斷及精準(zhǔn)治療靶點(diǎn)，對于卵巢癌早篩和治療都具有十分重要的意義。

目前已經(jīng)有越來越多的研究表明，LncRNA 在卵巢癌的發(fā)生、增殖、代謝、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥等多個生物學(xué)過程中均發(fā)揮著重要作用［6-9］。LIANG等［6］發(fā)現(xiàn)，LncRNA-PTAF 可以調(diào)控miR-25/SNAI2信號軸促進(jìn)卵巢癌發(fā)生EMT 和轉(zhuǎn)移。?ZES 等［28］研究表明，高表達(dá)LncRNA HOTAIR 能夠提示順鉑耐藥的發(fā)生，這樣的患者接受順鉑后發(fā)生死亡的風(fēng)險比低表達(dá)的病人高0.63～2.64 倍，但這種表達(dá)的差異對于未接受順鉑治療患者的死亡風(fēng)險并無明顯影響。

本研究結(jié)果提示LINC00467在卵巢癌組織和卵巢癌細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào)，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LINC00467高表達(dá)與卵巢癌患者的五年生存率等不良預(yù)后有明顯關(guān)系。通過細(xì)胞生物學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)LINC00467可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生增殖和促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，提示LINC00467 在卵巢癌中可能扮演一個癌基因的角色；揭示LINC00467可作為卵巢癌治療的一個潛在靶點(diǎn)，因此本研究對其具體調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了進(jìn)一步探討。

目前已知的研究中，比如在原發(fā)性肝癌中，LINC00467 的表達(dá)量降低，其通過miR-9-5p/PPARA 信號軸發(fā)揮抑制肝癌增殖、侵襲、遷移等惡性生物學(xué)表型作用［29］。ZHANG 等［19］發(fā)現(xiàn)LINC00467可能通過抑制P53 的表達(dá)而達(dá)到促進(jìn)腦膜瘤的進(jìn)展。李思瑩等［30］發(fā)現(xiàn)LINC00467 可能通過靶向調(diào)控miR-495-3p 而抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和凋亡。因此，LncRNA 能夠通過海綿化miRNA，將其從下游靶基因mRNA 的結(jié)合位點(diǎn)釋放，從而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。在前期的研究中通過生物信息學(xué)分析預(yù)測，發(fā)現(xiàn)LINC00467 中包含miR-302a-3p 的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)LINC00467 與miR-302a-3p 的表達(dá)量呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系，也通過通過熒光素酶報告實(shí)驗驗證了LINC00467 與miR-302a-3p 之間的直接結(jié)合關(guān)系，敲低LINC00467 可以顯著升高miR-302a-3p的表達(dá)水平，上述結(jié)果都驗證了筆者的推測，在卵巢癌中高表達(dá)的LINC00467可能通過miR-302a-3p 發(fā)揮促癌基因的作用。

為了進(jìn)一步探討LINC00467 和miR-302a-3p 之間的關(guān)系，明確上下游作用，需要在后續(xù)的深入研究中使用RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀明確LINC00467對miR-302a-3p 的直接調(diào)控機(jī)制，并探討下游的可能的mRNA，明確LINC00467 通過哪個信號軸調(diào)控卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。