Mus81基因沉默對MCF-7人乳腺癌細(xì)胞系增殖凋亡及化療敏感性的影響

常穎智 趙俐 張年偉 熊白玉 吳帆

1廣州市第一人民醫(yī)院，華南理工大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳腺外科（廣州 510180）；2廣州市紅十字會醫(yī)院普通外科（廣州 510220）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，現(xiàn)隨著一系列靶向藥物的面世，乳腺癌患者的預(yù)后得到了明顯提升［1-2］。但由于部分乳腺癌對傳統(tǒng)內(nèi)分泌及靶向治療均不敏感，因而尋找新的有效的治療靶點對改善乳腺癌預(yù)后至關(guān)重要［3］。甲磺酸鹽及紫外線敏感性81 號基因（methyl methanesulfonate and UV sensitive gene clone 81，Mus81）是定位于人11 號染色體長臂的DNA 修復(fù)基因，與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4-5］。已有研究［6-7］提示Mus81 是一個潛在的腫瘤治療靶點，沉默Mus81 基因的表達(dá)可抑制人結(jié)腸癌、肝癌細(xì)胞系的增殖并促進(jìn)凋亡，還可提高結(jié)腸癌及肝癌細(xì)胞系對化療藥物的敏感性。但關(guān)于Mus81 基因在乳腺癌中的作用及調(diào)控機制的研究目前還很少，尚有待進(jìn)一步研究闡明［8-9］。為此，本研究沉默MCF-7 細(xì)胞系中Mus81 基因的表達(dá)，以觀察其對MCF-7 細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及化療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞系購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。M-MLV 試劑盒購自Promega 公司；MTT 試劑購自上海鼎國生物技術(shù)有限公司；凋亡試劑盒購自美國Ebioscience 公司；PI 染色試劑盒購自德國Sigma 公司。

1.2 慢病毒介導(dǎo)的siRNA針對Mus81 目的基因序列，設(shè)計如下RNA 干擾靶點序列：正義鏈：5′-CCGGGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAAT -GTGATCCAGTACCAACTCTTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAAGAGTTGGTACTGGATCACATTCTCGAGAATGTGATCCAGTACCAACTC-3′；陰性對照序列為：正義鏈：5′-CCGGTTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTG-3′；反義鏈：5′-AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTAAGTTCTCTACGTGACACGTTCGGAGAA-3′。引物退火制備上述目的基因片段后與線性化載體連接并轉(zhuǎn)化，篩選、抽提獲取高純度質(zhì)粒。將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞，收集Mus81 沉默及陰性對照慢病毒感染MCF-7 細(xì)胞，分別命名為Mus81沉默組（Mus81-siRNA）及陰性對照組（NC-siRNA）MCF-7 細(xì)胞。感染3 d 后觀察慢病毒感染效率并采用RT-qPCR 檢測分析Mus81 基因的干擾效率。

1.3 RT-qPCR 檢測Trizol 試 劑提 取MCF-7 細(xì) 胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，行PCR 檢測，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s，然后95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共進(jìn)行45 個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法分析基因表達(dá)水平。

1.4 MTT檢測每組設(shè)3個復(fù)孔，將MCF-7細(xì)胞接種于96孔板，第2 天加入10 μL 的MTT（5 mg/mL），4 h 后吸去培養(yǎng)液，加入100 μL 二甲基亞砜。酶標(biāo)儀檢測490 nm 吸光度（OD）值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 細(xì)胞克隆形成實驗將MCF-7 細(xì)胞以800 個細(xì)胞/孔接種于6 孔板，每組設(shè)3 個復(fù)孔，培養(yǎng)至14 d，中途每隔3 d進(jìn)行換液。磷酸鹽緩沖液洗滌后加入1 mL 4%多聚甲醛固定30～60 min。加入結(jié)晶紫染液1 mL染細(xì)胞15 min，ddH2O洗滌后克隆計數(shù)。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測每個實驗組設(shè)3個復(fù)孔，MCF-7細(xì)胞以1 300 rmp 離心5 min，PBS 洗滌細(xì)胞。1×binding buffer 洗滌細(xì)胞沉淀1 次，1 300 rmp 離心3 min。200 μL 1×binding buffer 重懸細(xì)胞沉淀，加入10 μL Annexin V-APC 染色，上機檢測。

1.7 細(xì)胞周期檢測每個實驗組設(shè)3 個復(fù)孔，以1 300 rmp 離心5 min，PBS 洗滌細(xì)胞沉淀。再次以1 300 rmp 離心5 min 后加入配制好的PI 染色液重懸，上機檢測。

1.8 MTT 法測定化療藥物敏感性以順鉑、阿霉素、表阿霉素及5-氟尿嘧啶等4 種化療藥物按5 個濃度梯度（表1），分別處理Mus81 沉默組MCF-7 細(xì)胞和陰性對照組細(xì)胞，以未經(jīng)化療藥物處理的陰性對照組MCF-7 細(xì)胞作為空白組，MTT 檢測步驟同1.4，重復(fù)實驗3 次。繪制濃度-抑制率曲線并計算各化療藥物對兩組細(xì)胞的50%抑制濃度（IC50值），并計算Mus81 沉默對各化療藥物的逆轉(zhuǎn)指數(shù)（reverse index，RI）。

表1 各化療藥物的處理濃度Tab.1 The treatment concentrations of every chemotherapy drug

1.9 Western blot 檢測提取細(xì)胞總蛋白，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)至PVDF 膜。依次加入兔抗人STC2、APAF1、APC、PTEN、MAPK3或MAPK1 抗體及相應(yīng)二抗中孵育，經(jīng)顯影曝光攝片。以小鼠抗人β-actin抗體檢測相同樣本作為內(nèi)參照。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料比較采用Student′st檢驗，生長曲線采用重復(fù)測量資料的方差分析。所有分析均為雙側(cè)檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Mus81 的干擾效率熒光顯微鏡觀察顯示兩組細(xì)胞感染效率均高于80%（圖1A）。RT-qPCR 結(jié)果顯示Mus81 沉默組的Mus81 表達(dá)水平明顯低于陰性對照組［（0.272 ± 0.065）vs.（1.004 ± 0.116），P＜0.001，圖1B］，Mus81基因的沉默效率達(dá)72.8%。

2.2 MTT 生長曲線檢測Mus81 沉默組的MCF-7細(xì)胞吸光度值自第2天開始明顯低于陰性對照組，兩組生長曲線之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖1C），提示Mus81沉默后MCF-7細(xì)胞的生長速度明顯減緩。

2.3 平板克隆形成實驗Mus81 沉默組的細(xì)胞克隆數(shù)為（55 ± 5），明顯低于陰性對照組（273 ± 4），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，圖1D），提示Mus81 沉默明顯抑制了MCF-7 細(xì)胞的增殖。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測Mus81 沉默組的細(xì)胞凋亡率為（10.10±0.30）%，明顯高于陰性對照組的凋亡率（3.87±0.06）%（P＜0.001，圖1E），提示Mus81 沉默顯著促進(jìn)了MCF-7 細(xì)胞的凋亡。

2.5 細(xì)胞周期檢測Mus81 沉默組MCF-7 乳腺癌細(xì)胞中處于G1期的比例低于對照組［（32.00±1.87）vs.（47.76 ± 0.92），P＜0.001］，而處于G2/M 期的比例高于對照組［（21.75 ± 0.29）vs.（11.10 ± 0.36），P＜0.001］，兩組細(xì)胞中處于S期的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義［（41.85±1.29）vs.（40.70±0.70），P＞0.05，圖1F］，提示Mus81 沉默組MCF-7 細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的G2/M期阻滯。

圖1 沉默Mus81 基因?qū)θ橄侔㎝CF-7 細(xì)胞生長、增殖、凋亡和細(xì)胞周期的影響Fig.1 Effects of Mus81 gene silencing on the growth，proliferation，apoptosis and cell cycle of breast cancer MCF-7 cells

2.6 Mus81 沉默對化療敏感性影響順鉑、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶對Mus81 沉默組的IC50均明顯低于陰性對照組（圖2），Mus81 基因沉默對各化療藥物的RI 見表2，提示Mus81 沉默可明顯提高M(jìn)CF-7 細(xì)胞對順鉑、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶的化療敏感性。

圖2 順鉑、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶對兩組MCF-7 細(xì)胞的劑量-抑制率曲線Fig.2 Dose-inhibition rate curve of cisplatin，adriamycin，epirubicin and 5-fluorouracil on two groups of MCF-7 cells

表2 各化療藥物對兩組MCF-7 細(xì)胞的IC50及RI 值Tab.2 The values of IC50 and RI for the chemotherapy drugs on two groups of MCF-7 cells

2.7 Mus81 下游蛋白及基因表達(dá)水平Mus81 沉默組MCF-7 細(xì)胞中APAF1、APC 及PTEN 蛋白的表達(dá)水平明顯升高，MAPK3 和MAPK1 蛋白的表達(dá)水平明顯下降，STC2 蛋白的表達(dá)水平則無顯著變化。qRT-PCR 檢測顯示APAF1、APC 和PTEN 在Mus81 沉默組中的表達(dá)較對照組升高，特別是APAF1 基因表達(dá)升高超過2.0 倍，APC 基因表達(dá)升高超過1.5 倍，而MAPK3 和MAPK1 的表達(dá)則明顯降低（圖3）。

圖3 Mus81 下游蛋白及基因表達(dá)水平結(jié)果Fig.3 The results of protein and gene expression levels downstream of Mus81

3 討論

既往研究顯示，Mus81 在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且其表達(dá)水平與乳腺癌TNM 分期相關(guān)［9］。本研究的細(xì)胞學(xué)實驗顯示Mus81 基因沉默后可抑制人乳腺癌細(xì)胞系的生長及克隆。這些結(jié)果與筆者前期在結(jié)腸癌細(xì)胞系及肝癌細(xì)胞系中獲得的結(jié)果相一致，進(jìn)一步提示Mus81 可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長增殖［10］。但是，吳云路［8］等的結(jié)果顯示，過表達(dá)Mus81 可抑制人乳腺癌SKBR3 細(xì)胞系的增殖能力；YIN 等［11］在胃癌中的研究則顯示Mus81 沉默對胃癌細(xì)胞系的增殖無明顯的影響，提示Mus81 可能對不同的惡性腫瘤細(xì)胞的增殖具有不同的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mus81 沉默明顯促進(jìn)了MCF-7 細(xì)胞的凋亡。這與Mus81沉默促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的凋亡結(jié)果相一致，提示Mus81 沉默引起的細(xì)胞凋亡可能是導(dǎo)致MCF-7 細(xì)胞增殖抑制的原因之一?？紤]到細(xì)胞周期阻滯是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的常見原因，本研究也發(fā)現(xiàn)Mus81沉默可誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)G2/M 期阻滯，這與HIYAMA 等［12］在HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞系中觀察到的結(jié)果一致，提示Mus81沉默誘導(dǎo)的G2/M 期阻滯可能是導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞生長增殖減緩并促進(jìn)凋亡的原因之一。

QIAN 等［13］研究Mus81 對化療藥物敏感性的影響發(fā)現(xiàn)，沉默Mus81可增強MCF-7和T47D乳腺癌細(xì)胞對5-FU 藥物的敏感性。本研究不僅進(jìn)一步驗證了Mus81 沉默可顯著提高M(jìn)CF-7 細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的敏感性，還發(fā)現(xiàn)Mus81 沉默可明顯提高M(jìn)CF-7 細(xì)胞對順鉑、阿霉素、表阿霉素等其他常用化療藥物的敏感性，提示Mus81 沉默可與上述化療藥物聯(lián)用以提高總體敏感性或減少化療藥物的用量以降低化療藥物的毒副作用。綜合以上研究提示，Mus81 基因在調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖凋亡及化療藥物敏感性上發(fā)揮了重要的作用，有望成為一個潛在的乳腺癌治療靶點。

為了初步探究Mus81 沉默抑制MCF-7 細(xì)胞增殖凋亡并調(diào)控化療敏感性的機制，本研究對前期研究中發(fā)現(xiàn)的6 個Mus81 下游基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示APAF1、APC 和PTEN 在Mus81 沉默組MCF-7 細(xì)胞中的表達(dá)升高，而MAPK3 和MAPK1表達(dá)降低，其中又以APAF1 和APC 表達(dá)水平的變化幅度最大，這與本研究團(tuán)隊前期在肝癌中獲得的結(jié)果基本一致［10］。已有的研究發(fā)現(xiàn)APAF1對細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用，APAF1 的過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可將MCF-7 細(xì)胞阻滯在G1/S 期［14-15］。APC 則是一種多功能抑癌基因，LV 等［16］研究發(fā)現(xiàn)miR-135b 可通過下調(diào)APC 表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)三陰性乳腺癌的增殖和侵襲。綜合文獻(xiàn)報道及本研究結(jié)果，推測Mus81 沉默可能通過影響APAF1、APC 等基因的表達(dá)調(diào)控MCF-7 細(xì)胞的增殖凋亡及化療敏感性，但Mus81 調(diào)控下游基因的具體機制仍有待研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Mus81 基因沉默可明顯抑制MCF-7 細(xì)胞系的生長增殖并誘導(dǎo)G2/M 期阻滯及細(xì)胞凋亡，還可提高M(jìn)CF-7 細(xì)胞對順鉑、阿霉素、表阿霉素和5-氟尿嘧啶等化療藥物的敏感性，其機制可能與調(diào)控APAF1、APC 等下游基因的表達(dá)水平有關(guān)，提示Mus81 可能是一個潛在的乳腺癌治療靶點。