可降解鎂基金屬骨感染修復(fù)材料的研究進展

洪嘉穎 張濤

中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科（廣州 510010）

開放性骨折是骨科的常見損傷，在治療中繼發(fā)的骨感染給患者帶來嚴重的健康威脅［1］。據(jù)報道，在開放性骨折中骨感染發(fā)生率高達1.4%～22.7%［2］，而骨折相關(guān)感染（fracture-related infection，F(xiàn)RI）的病死率占全部創(chuàng)傷中晚期病死率的70%以上，并且45%的院內(nèi)FRI 由術(shù)中內(nèi)植入物引起［3］。研究表明，細菌易附著于感染灶局部死骨及內(nèi)植入物表面，形成的細菌生物膜能阻止抗生素滲透，并且其表型不同于浮生細菌，所以抗生素及人體的免疫系統(tǒng)都難以有效殺滅生物膜上的細菌［4-6］。目前骨感染的治療措施包括手術(shù)清創(chuàng)、針對性的抗菌治療及體內(nèi)植入含抗生素的材料［3，7］，術(shù)中清創(chuàng)時難以徹底消滅細菌及其生物膜。長期使用廣譜抗生素或植入含抗生素的材料，可誘導(dǎo)細菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，出現(xiàn)具備多重耐藥性的“超級細菌”［8］。鑒于目前骨感染治療措施的諸多局限性，探索新的骨感染治療策略顯得尤為重要［9］。

在骨感染的發(fā)生發(fā)展過程中，細菌在死骨或植入物表面定植形成細菌生物膜是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［9］，相應(yīng)地，從細菌粘附-定植的角度，賦予植入材料良好的抗菌性能，在細菌生物膜形成初期，抑制細菌的粘附及定植，從而阻止生物膜的產(chǎn)生，是目前骨感染相關(guān)研究的一大熱點［10-11］。對于骨感染內(nèi)植入物而言，除了可以預(yù)防細菌定植外，還需要具備良好的生物相容性、骨傳導(dǎo)/誘導(dǎo)能力［12］。而臨床上常用的含抗生素的磷酸鈣骨水泥及陶瓷，在體內(nèi)不可降解，植入后需二次手術(shù)取出，給患者帶來巨大的痛苦。鎂基金屬材料具備優(yōu)異的在體可降解性、良好的生物相容性和促骨再生性能等特點，早在1878年就進入臨床，作為結(jié)扎線用于縫扎血管。在20 世紀早期，一系列研究報道了使用鎂及其合金作為內(nèi)固定材料，用于治療各類骨折。報道提及鎂及其合金在植入患者體內(nèi)4～8 周后降解徹底，使鎂板及螺釘?shù)膬?nèi)固定時效縮短，并產(chǎn)生大量氣體出現(xiàn)皮下氣腫［13］。鎂的降解速率過快，機械性能不足限制其進一步發(fā)展。近些年來，冶金技術(shù)的進步使研究人員能夠制備耐腐蝕性更強、機械性能更好的鎂基材料，促使研究者重新探索鎂基材料在臨床應(yīng)用中的使用價值，現(xiàn)已成為當前骨植入材料的一大研究熱點［14］。

1 鎂基金屬作為骨植入材料的優(yōu)點

1.1 機械性能及生物學(xué)性能鎂質(zhì)輕，密度1.74 g/cm3，比鋅（7.133 g/cm3）、銀（10.5 g/cm3）更接近皮質(zhì)骨的密度［15］。純鎂的彈性模量（40～44 GPa）比常用的金屬植入物（鈦110～117 GPa，不銹鋼189～205 GPa）更接近皮質(zhì)骨的彈性模量（17GPa）［15］，可以減少因彈性模量不匹配而引起的應(yīng)力屏蔽［17-18］，從而降低植入體松動的發(fā)生率［19］。鎂離子是人體含量第4 的陽離子，其中，一半左右存在骨組織中［19］。另外，鎂還參與人體內(nèi)一系列生化反應(yīng)，參與人體新陳代謝，更是人體內(nèi)300 余種酶的輔助因子［20］。鎂及其合金在體外溶液及體內(nèi)環(huán)境均可降解，降解速率較鐵及其合金更快；還具有優(yōu)異的生物相容性：降解過程釋放的鎂離子可用于人體正常生理生化反應(yīng)［18-20］。鎂在體內(nèi)降解后釋放的鎂離子還具有促成骨及促血管生成的能力［18-20］。

1.2 抗菌性能鎂自身具有一定的抗菌性能［22］。ROBINSON 等［23］通過將不同質(zhì)量的純鎂加入細菌培養(yǎng)液中，制備不同濃度鎂離子、不同pH 值的培養(yǎng)液，并研究其對大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單純鎂離子濃度增加并不能抑制細菌生長，而高pH 微環(huán)境對三種細菌均有抑制作用。這一研究說明鎂主要通過在降解的過程中產(chǎn)生的局部高pH 值的微環(huán)境實現(xiàn)對細菌的殺滅作用。

1.3 純鎂在抗感染骨感染修復(fù)材料中存在的問題純鎂在體外實驗中表現(xiàn)出一定的抗菌能力，體內(nèi)實驗卻發(fā)現(xiàn)純鎂對細菌未顯示出抑制效果［24-25］。PENG 等［26］將純鎂、純鈦植入已接種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的股骨缺損大鼠，術(shù)后2、4 周發(fā)現(xiàn)股骨內(nèi)有大量空洞形成及皮質(zhì)骨破壞，并且鎂、鈦植入物及股骨表面均可見大量細菌粘附，炎癥細胞充斥股骨皮質(zhì)的腔隙。此外，鎂是活潑金屬，在體外內(nèi)環(huán)境下，其表面發(fā)生不均勻電偶腐蝕產(chǎn)生大量氫氣，同時在鎂表面形成氫氧化物層。氫氧化物層在氯離子存在的情況下易于分解，隨后發(fā)生點腐蝕。點腐蝕是一種嚴重的腐蝕形式，能在鎂表面形成凹坑，并迅速穿透鎂基體，降低植入物的承載能力，形成金屬內(nèi)裂紋。應(yīng)力作用下表面凹坑易腐蝕開裂，裂紋的發(fā)展也會導(dǎo)致體內(nèi)植入物的失效［27］。因此，體內(nèi)抗菌性能以及耐腐蝕性能這兩大短板限制了鎂基植入材料的進一步臨床應(yīng)用。

2 當前處理技術(shù)

純鎂的體內(nèi)抗菌性能不足及降解速率過快，制約了純鎂在骨感染修復(fù)中的臨床應(yīng)用。當前提高純鎂的體內(nèi)抗菌性能及耐腐蝕性的方法主要有：添加合金元素、表面改性技術(shù)。

2.1 添加合金元素將鎂和其他抗菌金屬材料混合熔煉、冷凝后制成的鎂合金在降解過程中能釋放出抗菌離子，有效提高抗菌性能。目前發(fā)現(xiàn)具備抗菌活性、生物安全性良好的金屬離子有銀離子、鋅離子、銅離子［28］。

2.1.1 銅離子Ag+、Cu2+和Zn2+等金屬離子溶解釋放的抗菌過程包含3 個環(huán)節(jié)：金屬離子與細菌的細胞膜上的氨基團、羧基團及蛋白質(zhì)形成強鍵，使之失效，繼而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化；細菌的細胞膜滲透性增加，膜內(nèi)外物質(zhì)運輸障礙；離子滲透到細胞質(zhì)作用于核酸抑制細菌增殖，最終導(dǎo)致細菌死亡［22］。Ag+、Cu2+和Zn2+等金屬離子還能催化活性氧生成，破壞細菌的細胞膜［29］。LI 等［20］構(gòu)建了不同銅含量（0.00、0.05、0.10 和0.25 wt%）的鎂銅合金，將合金提取液分別與大腸桿菌、表皮葡萄球菌共培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)，Mg-0.25Cu 組表面定植細菌稀少，呈不規(guī)則形態(tài)，甚至完全溶解。說明Mg-0.25Cu 提取物顯示出優(yōu)異的抗菌性能，顯著抑制細菌粘附并阻止形成生物膜。將不同銅含量的鎂銅合金植入至新西蘭兔骨髓炎模型中，結(jié)果顯示Mg-0.25Cu 可以在體內(nèi)抑制骨感染及炎癥，修復(fù)感染繼發(fā)的骨缺損。LIU 等［30］構(gòu)建了3 種不同銅含量（0.05、0.2和0.5 wt%）的鎂銅合金，在體外浸泡實驗中發(fā)現(xiàn)Mg-xCu 合金組的pH 值始終高于純Mg 組的pH 值，且Cu 含量越多，抗菌效果越明顯。進一步將合金提取液與含金黃色葡萄球菌的細菌懸浮液共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Mg-xCu 合金的抗菌效果優(yōu)于純鎂組，且Cu 含量越高，抗菌效果更明顯，作者進一步提出，Mg-xCu 在降解早期加速堿性環(huán)境的形成，并釋放具有生物活性的銅離子，從而協(xié)同發(fā)揮抗菌作用。

2.1.2 鋅離子鋅離子的抗菌機制還包括以下兩種：一是鋅離子通過催化反應(yīng)使水與空氣中的氧生成羥自由基和活性氧離子，產(chǎn)生氧化還原反應(yīng)，抑制細菌的增殖；二是大量帶正電的鋅離子依靠庫侖力與帶負電荷的細胞膜牢固吸附，穿透細胞壁，使細胞壁破裂，細胞質(zhì)外流，從而殺滅細菌［31］。HE 等［32］制備了不同鋅含量（0、2、4 和6 wt%）的四元鎂鈣鍶鋅合金，在體外分別用合金提取液、合金與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)所有含鋅合金及提取液均具有較強的抑菌性能，尤其是含鋅量較高的材料。QIN 等［32］構(gòu)建了四元鎂鋅釹鋯合金，體外抗菌實驗顯示，純鎂和鎂鋅釹鋯合金均能抑制大腸桿菌、表皮葡萄球菌及金黃色葡萄球菌的粘附及生物膜形成，而且鎂鋅釹鋯合金上的抗菌性能最佳。將不同材料植入至大鼠股骨骨髓炎模型中，結(jié)果顯示鎂鋅釹鋯合金組產(chǎn)生的氣體量、骨溶解及骨膜反應(yīng)較純鎂組顯著減少。接著平板菌落計數(shù)顯示，鎂鋅釹鋯合金植入物的表面細菌數(shù)均小于純鎂組。

2.1.3 銀離子銀離子除了上述提到的提高細菌的細胞膜通透性及生成活性氧的抗菌機制外，有研究還發(fā)現(xiàn)，銀離子可以使細菌細胞膜和細胞內(nèi)酯酶活性下降，進而使細菌表現(xiàn)出生理活性但不能繼續(xù)增長繁殖的狀態(tài)［34］。FENG 等［35］制備了不同銀含量（0、0.2、0.4、0.6 和0.8 wt%）的可降解五元鎂鋅釔釹銀（Mg-Zn-Y-Nd-xAg）合金，分別將不同的Mg-Zn-Y-Nd-xAg 合金放入含金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的培養(yǎng)基中共培養(yǎng)，結(jié)果顯示Mg-Zn-Y-Nd-xAg 合金對金黃色葡萄球菌的抗菌作用隨著銀含量的增加而增強，其中Mg-Zn-Y-Nd-0.4Ag 合金組的抗菌效果最佳。

2.1.4 鎵離子鎵的離子半徑、電離勢及電子親和力和鐵非常相似，細菌由于無法辨別鎵和鐵，外源性鎵被細菌吸收后會取代蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的鐵，干擾鐵代謝，使細菌的鐵依賴性功能喪失。鎵離子還可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)對細菌產(chǎn)生殺滅作用［36］。GAO 等［37］制備含0.1wt%鎵、鍶的鎂鎵、鎂鍶及鎂鎵鍶合金，在體外分別與金葡菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌懸浮液共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含鎵的鎂合金的殺菌性能均優(yōu)于不含鎵的鎂合金。進一步將鎂鎵鍶合金植入大鼠股骨金葡菌感染骨髓炎模型，觀察到鎂鎵鍶合金植入物表面的金葡菌數(shù)量最少，以上結(jié)果表明添加鎵元素可提高鎂基材料的抗菌性能。

2.2 表面改性鎂合金的表面改性是指在鎂合金表面制備功能性涂層，在提高合金的耐腐蝕性的同時，賦予材料抗菌性能。目前常用到的可降解鎂合金表面改性方法包括：微弧氧化、仿生涂層、離子注入及單分子層自組裝等。

2.2.1 微弧氧化20 世紀50年代，Markow 在陽極鋁片上進行陽極氧化實驗，提出了微弧氧化技術(shù)。我國直到20 世紀90年代才陸續(xù)開展微弧氧化的相關(guān)研究及工業(yè)應(yīng)用，取得了相應(yīng)的成就［38］。鎂合金微弧氧化是將鎂基材料放入特殊電解液的陽極端，在外部電流作用下依靠等離子體放電，從而在鎂基材料表面原位生成陶瓷膜或金屬氧化物涂層［39］；通過改變制備條件或在電解液中添加膠體可以調(diào)控陶瓷膜的厚度、成分及膜層的微觀構(gòu)造，制成的表面多孔結(jié)構(gòu)能有效提高金屬的耐腐蝕性和細胞相容性。在微弧氧化的電解液中加入抗菌金屬元素，還可以進一步賦予材料表面抗菌性能［40］。REN 等［41］使用微弧氧化技術(shù)在純鎂表面構(gòu)建硅涂層；并與化學(xué)轉(zhuǎn)化法制備的氟涂層、沉積法構(gòu)建的硅涂層相對比，評估不同涂層的抗菌性能，結(jié)果顯示微弧氧化法制備的含硅涂層具備多孔結(jié)構(gòu)，在與細菌懸浮液共培養(yǎng)時，提供鎂基體與菌液的接觸界面，使細菌培養(yǎng)液的局部pH 值增加，表現(xiàn)出較強的抗菌能力。而另外兩種涂層過于致密，細菌培養(yǎng)液的pH 值沒有變化，對細菌的抑制效果不明顯。劉繼光等［42］采用微弧氧化技術(shù)在純鎂表面制備不同含銀量的涂層，并與大腸桿菌和金葡菌共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，含銀的微弧氧化涂層的抗菌活性較不含銀的涂層顯著增強。SALIM等［43］首先將鎂鋅合金浸泡在含硅酸鈉和氫氧化鉀的電解液中制得微弧氧化涂層，再使用物理氣相沉積技術(shù)在微弧氧化涂層表面沉積銀元素，從而在鎂鋅合金上制備了基于銀的生物陶瓷涂層。將涂層置于大腸桿菌、金葡菌懸液，在37 ℃下孵育24 h 后，觀察到與普通微弧氧化表面涂層相比，銀沉積的微弧氧化涂層表面上的活性菌落數(shù)量顯著減少。

2.2.2 仿生涂層技術(shù)自從1986年，首次使用含羥基磷灰石涂層的內(nèi)植入物固定100 例全髖關(guān)節(jié)置換并取得良好療效后，仿生涂層技術(shù)逐漸得到推廣應(yīng)用［44］。仿生涂層技術(shù)是指利用電化學(xué)或化學(xué)方法在金屬材料表面沉積形成粘附力強的難溶性化合物涂層，如氫氧化鎂/氧化鎂、硫酸鹽、磷酸鹽、氟化物涂層等。YAN 等［45］將鎂鋅合金浸泡在30 ℃下50 wt%的氫氟酸溶液中48 h，沖洗干燥后制得含氟化物涂層的鎂鋅合金。電化學(xué)阻抗譜結(jié)果表明，氟化物涂層顯著提高了鎂鋅合金的耐腐蝕性能。體外細胞安全性實驗表明，含氟涂層的鎂鋅合金對人骨髓間充質(zhì)干細胞無毒性，同時對大腸桿菌有抗菌效果。ZHOU 等［46］采用仿生涂層技術(shù)將鋅摻雜到ZK60 鎂合金表面的羥基磷灰石涂層中，隨著鋅的添加，涂層上出現(xiàn)具有強耐腐蝕性的納米晶須結(jié)構(gòu)。體外抗菌實驗結(jié)果顯示，隨著鋅含量的增加，涂層對金葡菌、大腸桿菌的抑制效果逐漸增強。殼聚糖是甲殼素脫乙?；笾匾a(chǎn)物，具有良好的生物安全性、生物相容性，具有抗菌、抗癌、促進傷口愈合等重要醫(yī)用價值。田金環(huán)等［47］通過對殼聚糖進行改性，成功制備了殼聚糖季銨鹽。先對AZ91 鎂合金進行微弧氧化，然后在仿生溶液中添加1.25 mg/mL 殼聚糖或殼聚糖季銨鹽，再將微弧氧化前/后的AZ91 分別放入仿生溶液中，最終在微弧氧化前/后的鎂合金表面制備得到4 種不同的殼聚糖涂層。進一步選用金葡菌進行體外抑菌實驗，實驗結(jié)果表明，改性后的殼聚糖季銨鹽比殼聚糖具有更強的抑菌作用，微弧氧化的鎂合金在添加殼聚糖季銨鹽仿生溶液中礦化制得的樣品對金葡菌具有較強的抑制作用。通過體外降解實驗計算以上4 種樣品的失重率，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合微弧氧化和礦化得到的樣品的降解速率最慢（15 d 的失重率是0.02%），耐腐蝕性能最好。

2.2.3 等離子注入等離子表面改性技術(shù)，包括等離子噴涂、等離子聚合和等離子注入技術(shù)，其中等離子注入技術(shù)結(jié)合了傳統(tǒng)等離子體和離子束技術(shù)的優(yōu)點，通過高壓電場將不同種類的元素和官能團注入材料表面，具有全方位的加工能力，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)行業(yè)的改性［48］。LIN 等［49］利用等離子體離子浸沒注入技術(shù)在WE43 鎂合金表面構(gòu)建了TiO2/Mg2TiO4涂層。由于TiO2涂層具有光動力殺菌作用，在紫外線催化下含涂層的WE43 鎂合金產(chǎn)生大量的活性氧（ROS）自由基，從而殺死表面99.90%的金黃色葡萄球菌。此外，在電化學(xué)浸泡14 d 后，不含涂層的WE43 鎂合金組的溶液pH、Mg2+濃度及失重率顯著高于含涂層組，說明經(jīng)離子注入處理的WE43 合金能減少體外的腐蝕速率。進一步研究發(fā)現(xiàn)，氧化鈦涂層能使合金表面鈍化，使得WE43鎂合金的耐腐蝕性也得到顯著提高。

2.2.4 單分子層/逐層自組裝單分子層自組裝是利用有機物分子的分子間作用力和化學(xué)鍵自發(fā)吸附到薄膜層或固體表面形成涂層的技術(shù)；而逐層自組裝技術(shù)利用分子間的靜電吸引作用在鎂基材料表面疊加多個單分子層。REZK 等［50］先用氫氟酸和多巴胺三鹽酸溶液處理鎂合金AZ31，隨后利用生成的聚多巴胺涂層中的還原性兒茶酚基團原位固定金/銀離子，在原有涂層上形成均勻分布的金/銀納米顆粒。這些納米顆粒可以通過影響細菌的代謝及DNA 復(fù)制能力，從而對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌發(fā)揮明顯的殺滅作用。CUI等［51］通過靜電吸附作用將殼聚糖和聚-L-谷氨酸逐層自組裝，在鎂合金表面構(gòu)建了具有耐腐蝕性和抗菌性能的有機生物涂層，該涂層對金黃色葡萄球菌具有良好的殺滅作用，電化學(xué)腐蝕實驗提示添加有機生物涂層能顯著提高鎂合金的耐腐蝕性能。

3 臨床應(yīng)用

伴隨著冶金工藝的進步，機械性能更優(yōu)、耐腐蝕性更強的鎂基材料逐漸涌現(xiàn)，相應(yīng)的體外和動物體內(nèi)實驗也進一步證明鎂金屬在骨科內(nèi)植入材料領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價值，隨后的臨床研究也取得較好的結(jié)果。WAIZY 等［52］首次使用Mg-Y-RE-Zr螺釘治療拇外翻，術(shù)后的各類關(guān)節(jié)功能評分與對照組（標準鈦螺釘）均無明顯差異?；谶@項試驗結(jié)果，Mg-Y-RE-Zr 螺釘成功獲得歐洲一致性認證標志，獲批進入醫(yī)療器械市場，隨后相繼應(yīng)用于各類骨折手術(shù)（表1）［53-66］，術(shù)后隨訪療效佳。

表1 鎂合金臨床研究的情況Tab.1 Status of clinical studies on magnesium alloys

LEE 等［53-66］使用Mg-5Ca-1Zn 螺釘治療橈骨遠端骨折，術(shù)后1年鎂基螺釘完全降解，骨折端愈合良好，證明Mg-5Ca-1Zn 螺釘擁有良好的機械性能和耐腐蝕性能。趙德偉等［68］使用可降解純鎂（99.99 wt%）螺釘固定帶血管蒂骨瓣，治療Ⅱ/Ⅲ期股骨頭壞死患者。在術(shù)后12 個月的隨訪期間，通過X 線及CT 檢查發(fā)現(xiàn)純鎂螺釘具有促進成骨、耐腐蝕性更強的優(yōu)點，同時使用鎂螺釘組的Harris 髖關(guān)節(jié)評分（HHS）優(yōu)于對照組的評分，證明了純鎂作為骨科內(nèi)固定材料治療股骨頸骨折及發(fā)育性髖關(guān)節(jié)不良，術(shù)后隨訪骨愈合率良好［13，69］，具有廣闊的應(yīng)用前景?？梢?，可降解鎂基材料具有良好的機械性能及耐腐蝕性能，在骨科內(nèi)植入材料領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。

4 總結(jié)與展望

由于鎂及鎂合金具有在體可降解性、良好的生物安全性、促成骨、促血管等優(yōu)點，近年來逐漸成為可降解植入材料的一大研究熱點。現(xiàn)有的基礎(chǔ)及臨床研究大都集中在提高鎂作為內(nèi)固定材料的耐腐蝕性能及機械性能方面，若能在進一步提高鎂合金在人體內(nèi)的耐腐蝕性能的同時，發(fā)掘其抗菌性能，將有利于推動其在骨修復(fù)，尤其是骨感染修復(fù)領(lǐng)域中的應(yīng)用。此外，目前抗感染鎂基材料的研究大多停留在體外實驗階段，未來仍需開展更多的體內(nèi)研究，全面評估其臨床應(yīng)用的安全性及有效性。