一株霍亂弧菌的分離鑒定和治療藥物篩選

沈 飛，孫瑜翀，竇梓韞，呂利群

(上海海洋大學國家水生動物病原庫，上海 201306)

2020年8月，佛山市杏壇鎮(zhèn)一養(yǎng)殖場出現(xiàn)太陽魚暴發(fā)性死亡。5月開始發(fā)病，瀕死魚可見體表輕微發(fā)紅，死魚全身發(fā)紅，解剖可見內臟出血發(fā)紅，當地人稱之為“紅身病”。該病發(fā)展迅速，第1天死魚一二十尾，第2天達上百尾，第3天達三五百尾，呈翻倍增多，控制不及時日死亡量可達幾千尾，死亡率約70%。為查明病因，本實驗室通過生理生化指標、分子生物學技術和人工感染實驗確定了一株優(yōu)勢株，并進行抗生素和消毒劑篩選，為該病的臨床診斷和藥物防治提供參考。

一、材料和方法

1.實驗材料

筆者將具有典型紅身癥狀的患病個體作為研究材料，記錄病魚的體征和癥狀，解剖以觀察內臟的病理變化。健康太陽魚也來自該養(yǎng)殖場，體質量50～80克，暫養(yǎng)1周后用于攻毒實驗。

LB瓊脂、MH瓊脂和革蘭氏染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；HBI霍亂弧菌生化鑒定條(SN)、TCBS瓊脂購自青島高科園海博生物技術有限公司；基因組DNA提取試劑盒，2×TaqPCR MasterMix(不含染料)購自天根生化科技(北京)有限公司；水產消毒劑產品購自山西爭躍藥業(yè)有限公司；PCR引物合成及產物測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

2.病原菌分離鑒定

取瀕死的有明顯紅身癥狀的太陽魚，無菌操作下用75%酒精棉球擦拭魚體，解剖并取其肝、脾、腎組織劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)24小時后挑取單菌落純培養(yǎng)。將分離純化后的單菌落接種于TCBS培養(yǎng)基，30℃下培養(yǎng)24小時后進行菌落形態(tài)觀察。參照《進出口食品中霍亂弧菌檢驗方法》(SN/T1022-2010)，按試劑盒說明書進行生理生化鑒定。

用天根細菌DNA提取試劑盒提取細菌DNA，用16SrDNA通用引物(27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT)和霍亂弧菌pntA特異性引物(F：CAGTAAAGAAACGACCAAACTC；R：TGCCAGTTTCGATGATGCCG)進行PCR鑒定，將預期大小的PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

3.藥敏分析和消毒劑篩選

采用藥敏紙片法篩選敏感抗生素，采用二倍稀釋法測定消毒劑對菌的最小殺菌濃度和最小抑菌濃度。消毒劑濃度為2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、0毫克/升。

二、結果

1.病理特征及菌落特性

病魚最明顯的外部特征是體表發(fā)紅(圖1A)，解剖后發(fā)現(xiàn)肝臟有出血(圖1B)。分離株命名為SF01，在TCBS瓊脂培養(yǎng)基中菌落為黃色(圖1C)。

圖1 病魚臨床體征及菌落形態(tài)

2.生理生化鑒定

生化鑒定結果(表1)顯示，SF01氧化酶陽性，能利用蔗糖和甘露糖分解鳥氨酸脫羧酶和精氨酸雙水解酶，與霍亂弧菌的生理生化指標基本符合。

表1 SF01生理生化特征

3.16SrDNA和pntA檢測結果及系統(tǒng)進化樹構建

測序與系統(tǒng)進化樹結果顯示，SF01與V.choleraeNR.044853、V.choleraeNR.115936聚為一枝，具有較近的親緣關系。基于pntA設計的霍亂弧菌特異性引物擴增出338bp的產物，綜合其菌落形態(tài)，生理生化特征可判定分離株為霍亂弧菌。

4.藥物敏感分析

藥敏分析結果(表2)表明，分離株SF01對恩諾沙星、卡那霉素、頭孢哌酮舒巴坦、強力霉素、磺胺復合物、氟苯尼考、利福平、氧氟沙星、磷霉素和環(huán)丙沙星極敏感，對阿奇霉素、頭孢呋新鈉、諾氟沙星、慶大霉素、鏈霉素、新霉素和妥布霉素高度敏感，對氨芐西林中敏，對新諾明和林可霉素表現(xiàn)為耐藥。通過二倍稀釋法測量消毒劑對分離菌SF01的最小抑菌濃度(MIC)，并挑選效果較好的消毒劑殺毒先鋒、草鯽五病靈、草魚烏頭黑病靈、菌迪、暴血安、魚用暴血止和菌血立停測量最小殺菌濃度(MBC)，結果見表3。由表3可知，消毒劑菌迪、魚用暴血安和暴血止等對分離菌的消毒效果最好，聚維酮碘效果較差。

表2 SF01藥敏試驗

表3 二倍稀釋法測定的MIC、MBC

三、小結

養(yǎng)殖場采用氟苯尼考內服，魚的日死亡量控制在100尾以下，直至無病魚出現(xiàn)，之后每月使用1次對分離株效果較好的消毒劑進行消毒，可以預防霍亂弧菌的暴發(fā)。