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    干細(xì)胞生長因子對胰腺癌細(xì)胞生長、遷移及神經(jīng)浸潤的影響

    2022-07-28 11:10:44尚萬兵吳文斌
    河南醫(yī)學(xué)研究 2022年13期
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞系胰腺癌試劑盒

    尚萬兵,吳文斌

    (1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 a.法學(xué)院;b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    胰腺癌是臨床常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤類型之一,其發(fā)病率和死亡率相當(dāng),預(yù)后差,患者5 a總生存率為5%,接受根除術(shù)治療后患者的5 a生存率也低于20%,若不接受臨床治療,患者的生存期約4個月[1-2]。近年來,隨著臨床治療手段的不斷完善,胰腺癌的治療方案(尤其是手術(shù)治療)取得了較大突破,但胰腺癌患者的預(yù)后仍不理想[3]。神經(jīng)浸潤是指腫瘤細(xì)胞在相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制下侵犯神經(jīng)的現(xiàn)象[4-5],目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰腺癌、直腸癌、胃癌等都存在神經(jīng)浸潤現(xiàn)象[6-8],同時也是胰腺癌預(yù)后差的主要原因之一。胰腺癌發(fā)生神經(jīng)浸潤概率可高達(dá)80%,但胰腺癌神經(jīng)浸潤的分子機(jī)制目前仍未完全闡明。干細(xì)胞生長因子(stem cell growth factors,SCF)是一種多效性細(xì)胞因子,可通過與c-kit受體(酪氨酸激酶受體)結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞遷移、細(xì)胞外基質(zhì)黏附以及調(diào)節(jié)因子分泌,可參與多種生理過程[9-10]。前期研究發(fā)現(xiàn)SCF因子在胰腺癌細(xì)胞中表達(dá)顯著升高,但其與胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的關(guān)系目前尚不清楚。本研究通過構(gòu)建SCF過表達(dá)胰腺癌細(xì)胞系以分析SCF對胰腺癌細(xì)胞生長、遷移及神經(jīng)浸潤的影響。

    1 一般資料

    1.1 實驗材料和儀器裸鼠(6~8周)購自上海斯萊克生物有限公司;人胰腺癌PANC-1、AsPC-1和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6-C7購自美國ATCC公司;SCF慢病毒由山東維真生物科技有限公司構(gòu)建、生產(chǎn)并濃縮;總RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國QIAGEN公司;2×SYBR Green qPCR Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TAKARA公司;DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Invitrogen公司;兔抗人SCF兔多克隆抗體購自美國Abcam公司;β-actin單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司;辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;CCK-8檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所;熒光定量PCR儀購自Applied Biosystems公司;熒光顯微鏡和光學(xué)顯微鏡購自日本奧林巴斯;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

    1.2 SCF過表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建將指數(shù)生長期的胰腺癌PANC-1細(xì)胞、AsPC-1細(xì)胞置于2.5 g·L-1胰酶中消化,接種細(xì)胞至6孔板(10 000個/孔),細(xì)胞貼壁后,將PANC-1細(xì)胞分為對照組1和過表達(dá)組1,AsPC-1細(xì)胞分為對照組2和過表達(dá)組2,并分別向培養(yǎng)液中加入100 μL病毒溶液、SCF過表達(dá)病毒溶液,感染48 h,結(jié)束后嘌呤霉素處理,殺死未感染的細(xì)胞,存活的細(xì)胞即為穩(wěn)定細(xì)胞系,采用熒光定量PCR和免疫印跡試驗(Western blot)鑒定細(xì)胞中SCFmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

    1.3 熒光定量PCR分析SCFmRNA表達(dá)各組細(xì)胞系和HPDE6-C7細(xì)胞生長至指數(shù)生長期,收集細(xì)胞1×106個/每個樣,離心細(xì)胞棄上清,細(xì)胞沉淀采用RNA提取試劑盒提取總RNA,采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA,測定濃度備用。根據(jù)SCF基因序列設(shè)計如下引物:SCF-F為5’- AGGCAAGGTT TTCTACAGCATCAC-3’;SCF-R為5’-TAGTCTTTTGGAAGATTTGCC-3’。將合成的引物濃度稀釋為10 μmol·L-1,并對其特異性進(jìn)行分析。PCR反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR Green Mix 10 μL、SCF-F/R各0.6 μL、cDNA 8.8 μL。將上述所配混合物加入熒光定量PCR板,上熒光定量PCR儀檢測,PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,循環(huán)數(shù)40個,PCR結(jié)束后建立溶解曲線,并在儀器上直接讀數(shù),分析兩組mRNA水平。

    1.4 Western blot分析SCF的表達(dá)水平提取各組細(xì)胞系和HPDE6-C7細(xì)胞離心后細(xì)胞沉淀總蛋白,100 g·L-1SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上,50 g·L-1脫脂奶粉封閉1 h,50 g·L-1的脫脂奶粉稀釋兔抗人SCF抗體(1∶500)在4 ℃孵育12 h,PBS緩沖液洗滌3次,每次5 min,羊抗兔HRP標(biāo)記的二抗(1∶2 500)室溫孵育1 h,PBS洗滌3次后,增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液處理,收集影像,觀察蛋白表達(dá),以β-actin作為內(nèi)參。

    1.5 MTT測定胰腺癌細(xì)胞的增殖能力將對照組1和過表達(dá)組1、對照組2和過表達(dá)組2細(xì)胞系培養(yǎng)至指數(shù)生長期,用2.5 g·L-1胰酶消化后,細(xì)胞密度調(diào)整為1×105個·mL-1,接種100 μL細(xì)胞懸液于96孔板,預(yù)培養(yǎng)12 h,使細(xì)胞貼壁,分別繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24、48 h時,吸干培養(yǎng)液,每孔加入100 μL MTT溶液,繼續(xù)孵育3 h,酶標(biāo)儀測定在572 nm的吸光值,繪制增殖曲線。

    1.6 Transwell分析胰腺癌細(xì)胞侵襲能力用50 mg·L-1Matrigel 1∶8稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室面,4 ℃風(fēng)干,吸出培養(yǎng)板中殘余液體,備用。將對照組1和過表達(dá)組1、對照組2和過表達(dá)組2細(xì)胞系培養(yǎng)至指數(shù)生長期,用2.5 g·L-1胰酶消化后,細(xì)胞密度調(diào)整為1×106個·mL-1,取細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室,常規(guī)培養(yǎng)12~48 h,體積分?jǐn)?shù)為40 g·L-1多聚甲醛固定,1 g·L-1結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察單個視野細(xì)胞侵襲數(shù)目。

    1.7 神經(jīng)浸潤小鼠模型的構(gòu)建24只6~8周齡去胸腺裸鼠分為對照組和過表達(dá)組,采用異氟烷麻醉,暴露出其左側(cè)坐骨神經(jīng),分離肱二頭肌,采用顯微注射的方法分別將SCF過表達(dá)胰腺癌PANC-1細(xì)胞系、對照細(xì)胞系注入過表達(dá)組、對照組裸鼠坐骨神經(jīng)的神經(jīng)束膜,每只細(xì)胞水平為1×105個,體積為10 μL,建立坐骨神經(jīng)浸潤模型。注射后6周處死小鼠,免疫組化分析神經(jīng)浸潤情況。

    1.8 免疫組化分析神經(jīng)浸潤情況小鼠在建模6周后,麻醉處死小鼠,切取坐骨神經(jīng)和腫瘤組織石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟3次,每次10 min,依次放入梯度無水乙醇中水化,按試劑盒說明步驟進(jìn)行NF-200免疫組織化學(xué)染色。

    2 結(jié)果

    2.1 SCF穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建情況分析結(jié)果如圖1所示,對照組1胰腺癌細(xì)胞系SCFmRNA表達(dá)(0.98±0.16)、蛋白表達(dá)(0.41±0.09)均低于過表達(dá)組1(4.32±0.78、2.18±0.37)(P<0.05);對照組2胰腺癌細(xì)胞系SCFmRNA表達(dá)(1.01±0.12)、蛋白表達(dá)(0.48±0.10)均低于過表達(dá)組2(4.85±0.51、2.58±0.31)(P<0.05);正常胰腺細(xì)胞中SCFmRNA表達(dá)(0.36±0.08)、蛋白表達(dá)(0.15±0.05)均低于對照組1、對照組2(P<0.05)。

    A為熒光定量PCR電泳結(jié)果;B為SCF mRNA表達(dá);C為SCF蛋白表達(dá)條帶;D為SCF蛋白表達(dá);與對照組1比較,*P<0.05;與對照組2比較,#P<0.05。

    2.2 SCF對胰腺癌細(xì)胞增殖的影響結(jié)果如圖2所示,與對照組1比較,過表達(dá)組1各個不同時間點的增殖能力增加(P=0.011);與對照組2比較,過表達(dá)組2各個不同時間點的增殖能力增加(P=0.007)。

    與對照組1比較,*P<0.05;與對照組2比較,#P<0.05。

    2.3 SCF對胰腺癌侵襲能力影響結(jié)果如圖3所示,過表達(dá)組1細(xì)胞侵襲數(shù)目(85.41±12.19)高于對照組1(28.90±4.99)(P=0.001),過表達(dá)組2細(xì)胞侵襲數(shù)目(93.28±10.95)高于對照組2(34.11±6.51)(P=0.001)。

    A為結(jié)晶紫染色(100×);B為細(xì)胞侵襲數(shù)目;與對照組1比較,*P<0.05;與對照組2比較,#P<0.05。

    2.4 SCF對胰腺癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤能力的影響結(jié)果如圖4所示,在建立胰腺癌模型后6周,對照組12只小鼠4只出現(xiàn)了坐骨神經(jīng)功能障礙(33.33%),過表達(dá)組12只小鼠10只出現(xiàn)了坐骨神經(jīng)障礙(83.33%),其中4只完全癱瘓,兩組比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=6.171,P=0.013);免疫組化結(jié)果顯示NF-200陽性表達(dá)升高。

    圖4 SCF對胰腺癌細(xì)胞神經(jīng)浸潤能力的影響

    3 討論

    胰腺癌是起源于胰腺導(dǎo)管上皮、腺泡細(xì)胞的臨床上常見消化道難治性腫瘤,其發(fā)病具有隱匿特點,早期診斷較為困難,且該疾病進(jìn)展迅速,導(dǎo)致胰腺癌患者的生存時間短,預(yù)后較差[11]。因此,胰腺癌也是病死率最高的腫瘤類型之一,位居全球前十位。胰腺癌的發(fā)病病因尚未完全闡明,目前普遍認(rèn)為其發(fā)病與多種因素有關(guān),例如癌前病變、基因異常和遺傳等因素,同時不良的飲食習(xí)慣、肥胖、長期吸煙和胰腺慢性損傷是誘發(fā)胰腺癌發(fā)病的重要影響因素[12]。胰腺癌的發(fā)病、進(jìn)展機(jī)制是目前科學(xué)研究者和臨床醫(yī)生關(guān)注的熱點和難點。

    SCF定位于人12號染色體q22~q24區(qū)域,編碼248個氨基酸。SCF通過與其受體c-Kit結(jié)合,可激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,從而調(diào)節(jié)一些重要的基因轉(zhuǎn)錄[13]。目前已有研究顯示,C-KIT基因表達(dá)異常可刺激腫瘤細(xì)胞的持續(xù)增殖和抗凋亡信號的失控,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的惡性增殖,目前已經(jīng)在胃腸道間質(zhì)瘤、白血病、肺癌、結(jié)腸癌以及胰腺癌中觀察到C-KIT基因的異常表達(dá)[14-17]。本課題的前期研究表明,SCF在胰腺癌細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài),其主要可能通過c-kit激活,誘導(dǎo)胰腺癌的惡化。Kuai等[18]研究顯示,SCF參與胃癌細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)過程,本研究為進(jìn)一步探討SCF在胰腺癌中可能發(fā)揮的作用,體外構(gòu)建SCF穩(wěn)定過表達(dá)胰腺癌PANC-1細(xì)胞系和AsPC-1細(xì)胞系,并通過基因表達(dá)、蛋白表達(dá)實驗驗證穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建成功,同時還發(fā)現(xiàn)正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞HPDE6-C7中SCFmRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)均低于胰腺癌細(xì)胞。胰腺癌病情進(jìn)展迅速、患者預(yù)后差與惡性腫瘤細(xì)胞不受限的細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵染能力強(qiáng)等因素有密切關(guān)系,本研究發(fā)現(xiàn)SCF過表達(dá)PANC-1、AsPC-1細(xì)胞系的增殖活性較其陰性對照細(xì)胞系呈現(xiàn)出增長趨勢,說明SCF過表達(dá)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖活力,也間接說明SCF在胰腺癌細(xì)胞增殖過程中扮演著重要的角色。

    胰腺癌難治的原因眾多,其中包括癌細(xì)胞增殖迅速、容易轉(zhuǎn)移等。目前,普遍認(rèn)為神經(jīng)浸潤是惡性腫瘤細(xì)胞沿著神經(jīng)生長,或者是在神經(jīng)鞘的內(nèi)膜、神經(jīng)束膜、神經(jīng)外膜的層面有腫瘤細(xì)胞的現(xiàn)象,是導(dǎo)致胰腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)、難治和病死率高的主要原因。目前對于神經(jīng)浸潤的機(jī)制存在不同的觀點,這些觀點包括低阻力通道學(xué)說、癌細(xì)胞神經(jīng)相互作用學(xué)說以及神經(jīng)重塑和再生學(xué)說,雖然上述各種學(xué)說在一定程度上解釋神經(jīng)浸潤特點,但還是無法完全闡明胰腺癌神經(jīng)高發(fā)的主要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞的侵襲能力能夠反映細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤的特性,本研究發(fā)現(xiàn)SCF過表達(dá)PANC-1、AsPC-1細(xì)胞系的細(xì)胞侵襲數(shù)目高于其陰性對照細(xì)胞系,有研究發(fā)現(xiàn)SCF對間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移有促進(jìn)作用[19],還有研究表明c-Kit與SCF結(jié)合可提高上皮性的卵巢癌中干細(xì)胞存活率[20],本研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相似趨勢,說明SCF過表達(dá)可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞的侵襲能力,同時也提示SCF可能參與胰腺癌腫瘤的神經(jīng)浸潤。為證實這一假設(shè),本研究構(gòu)建坐骨神經(jīng)浸潤模型,并將SCF過表達(dá)細(xì)胞系和對照細(xì)胞系注射進(jìn)入坐骨神經(jīng)周圍,發(fā)現(xiàn)SCF過表達(dá)組裸鼠坐骨神經(jīng)障礙發(fā)生率為83.33%,陰性對照組裸鼠坐骨神經(jīng)障礙發(fā)生率為33.33%,兩組裸鼠坐骨神經(jīng)障礙發(fā)生率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,同時免疫組化結(jié)果顯示SCF過表達(dá)組裸鼠NF-200陽性表達(dá)升高,陰性對照組裸鼠的NF-200陽性表達(dá)很低,說明SCF過表達(dá)可以增強(qiáng)胰腺癌的神經(jīng)浸潤能力,并在胰腺癌神經(jīng)浸潤過程中發(fā)揮著重要作用。

    綜上所述,SCF表達(dá)升高可以增強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力,促進(jìn)胰腺癌神經(jīng)浸潤的發(fā)生,但其中SCF是通過何種作用機(jī)制促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、侵襲以及神經(jīng)浸潤情況,還需從生物學(xué)分子層面開展研究。

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