GPx5在牦牛隱睪附睪組織的分布特征及定位分析*

邢引弟，袁莉剛 ，陳少宇，馬曉杰，楊大鵬，王 華，宋娟娟

(甘肅農(nóng)業(yè)大學 動物醫(yī)學院，甘肅 蘭州 730070)

谷胱甘肽過氧化物酶-5 (glutathione peroxidase-5，GPx5)也稱附睪特異性谷胱甘肽過氧化物酶，最早分離自鼠類附睪精子，其蛋白大小為35 ku，是GPX家族中硒非依賴型谷胱甘肽過氧化物酶[1]。REJRAJI等[2]研究表明：GPx5在附睪中有可溶性、游離性和結合性3種蛋白形式。GPX活性受到抑制或還原型谷胱甘肽數(shù)量不足均可引起脂質過氧化增多。TAYLOR等[3]提出哺乳動物GPx5通過還原底物硫氧還蛋白 (thioredoxin，Trx)、減少氧化物單體和二聚體形成從而發(fā)揮抗氧化作用。GPx5在附睪各區(qū)域的表達具有種屬差異性。GRIGNARD等[4]研究報道：相比于馬屬動物，GPx5在牛附睪頭部表達量較高；而GPx5在山羊[5]、小尾寒羊[1]和駱駝[6]等動物的附睪特異性表達，能夠調節(jié)附睪管微環(huán)境活性氧含量，使精子免受脂質過氧化損傷，維持其活力和DNA完整性，且可防止精子在附睪尾部過早發(fā)生頂體反應，在雄性動物繁殖中發(fā)揮著重要作用。

在缺血或缺氧、離子輻射或紫外線照射等條件下，動物有機體可誘導附睪中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平升高。細胞抗氧化保護機制不足時，ROS大量堆積，會對細胞產(chǎn)生毒性，導致氧化和抗氧化系統(tǒng)調節(jié)功能失衡。GPX能夠及時清除生物體內(nèi)的自由基并維持代謝平衡，通過還原性谷胱甘肽催化過氧化物，保護細胞因子、蛋白和脂質體等敏感生物分子，使其避免受到自由基的氧化損傷[7]。研究表明：精液中低含量的ROS在維持精子成熟、運動和獲能等方面發(fā)揮著重要作用[8]。GPx5基因敲除小鼠的附睪尾部ROS水平升高，生育能力明顯下降，流產(chǎn)率增加，子代發(fā)育出現(xiàn)缺陷[9]。研究發(fā)現(xiàn)：相比于正常大鼠，GPx5在去勢大鼠附睪不表達；去勢14 d的大鼠注射睪酮后其GPx5基因表達量明顯增加，提示睪酮與GPx5基因表達量密切相關[10]。低氧環(huán)境中GPx5與附睪組織自由基結合，使之轉化成易代謝的酸類物質加速自由基排泄，減輕附睪上皮細胞損傷，促進精子成熟[11]。牦牛長期生活在高原低氧環(huán)境，是典型的季節(jié)性發(fā)情動物，由于附睪微環(huán)境的改變，導致其繁殖力下降。本研究以高原成年牦牛正常附睪和隱睪附睪為研究對象，采用實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡、免疫組織化學及免疫組織熒光等技術檢測其組織中GPx5的含量及分布特點，探討GPx5在牦牛附睪中的抗氧化機制，以期為提高牦牛的繁殖能力技術研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗樣品采自青海省西寧市大通牧區(qū)，選取體況相近的4歲成年牦牛8頭，分為2組，正常組和隱睪組各4頭。采用睪丸摘除手術取正常及隱睪附睪各8對，形態(tài)學組織樣本(附睪頭、附睪體和附睪尾)經(jīng)4 mL/L福爾馬林固定液固定備用；生物學試驗組織樣本置于液氮中，轉入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

正常組及隱睪組附睪頭、附睪體和附睪尾組織塊進行常規(guī)梯度酒精脫水、石蠟包埋和切片機連續(xù)切片(片厚4 μm)。切片用于組織特殊染色、GPx5免疫組織化學SP法染色及陰性對照和免疫熒光染色。

1.2.2 正常附睪和隱睪附睪的組織結構特點

采用HE染色并觀察。正常附睪和隱睪附睪組織樣本置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、攤片、粘片和烤片，脫蠟至水后將切片用蘇木精染色，經(jīng)鹽酸分化、自來水返藍和水洗后依次投入梯度酒精中脫水，再加入伊紅染色，經(jīng)無水乙醇和二甲苯透明，最后用中性樹膠封片，進行鏡檢并采集圖像，統(tǒng)計附睪管腔內(nèi)外徑、上皮厚度和纖毛長度。

1.2.3 正常附睪和隱睪附睪的免疫組織化學分布

采用免疫組織化學染色并觀察。切片經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫蠟和水洗后，采用檸檬酸鹽緩沖液高溫抗原修復10 min；PBS沖洗3次，滴加3%H2O2封閉過氧化物酶，37 ℃孵育15 min；PBS水洗，山羊血清白蛋白37 ℃孵育15 min，傾去勿洗，每張切片滴加50 μL兔源GPx5一抗(1∶400)，陰性對照組用 0.01 mol/LPBS代替一抗，4 ℃過夜；PBS水洗后滴加生物素標記IgG工作液，37 ℃孵育15 min；PBS水洗，滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育15 min；滴加DAB顯色液顯色，蘇木素(Mayer)復染3 min，自來水返藍10 min，脫水、透明和封片后進行顯微鏡觀察并拍照。附睪頭、附睪體和附睪尾各選取3個平行組織塊，顯微鏡下200倍視野隨機選取10個圓形附睪小管，采用Image-Pro Plus 6.0軟件采集數(shù)據(jù)，以積分光密度(IOD)對正常附睪和隱睪附睪的免疫組織化學分布進行分析。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測GPx5基因相對表達量

通過GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找牛源GPx5序列和β-actin序列，使用Primer-Blast 5.0設計引物，所用引物(表1)均由蘭州天啟基因生物有限公司合成。按照TransZol法提取牦牛正常附睪和隱睪附睪組織樣品總RNA，用超微量紫外分光光度計檢測RNA濃度和純度，并使用反轉錄試劑盒合成cDNA，-20 ℃保存。以反轉錄的cDNA作為模板進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)引物特異性強，可進行qRT-PCR試驗。反應總體系為20 μL，其中模板1 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL；反應條件為94 ℃預變性30 s，94 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，循環(huán)45次。正常組和隱睪組各存樣300 μL，每個樣品3個生物學重復。根據(jù)Ct值采用2-ΔΔCt分析GPx5mRNA的相對表達量。

表1 GPx5和β-actin基因引物來源Tab.1 Source of primers for GPx5 and β-actin genes

1.2.5 Western-blot檢測GPx5蛋白表達量

取牦牛正常附睪和隱睪附睪組織用液氮研磨，加入RIPA (組織裂解液) 1 mL，再加入PMSF 10 mL提取總蛋白，研磨組織樣品置于4 ℃冰箱裂解30 min，于4 ℃條件下10 000 r/min離心15 min，吸取上清液為樣品總蛋白。使用BCA試劑盒法進行總蛋白質量濃度測定，其蛋白質量濃度為280 pg/mL。待使用蛋白加入SDS-PAGE loading buffer (5×)，金屬浴95 ℃，變性10 min，保存至-20 ℃冰箱待用。變性蛋白經(jīng)過12% SDSPAGE電泳分離，總蛋白量為1.68 pg，每個泳道上樣6 μL，待電泳結束后轉至PVDF膜。將轉印有蛋白的PVDF膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，再分別使用兔源GPx5一抗(1∶500)和鼠源β-actin一抗(1∶3 000) 4 ℃孵育過夜。PBST洗膜2 h后，加入二抗(1∶3 000)，37 ℃孵育1 h，最后使用ECL曝光及成像采集。

1.2.6 GPx5的定位分析

采用免疫熒光組織化學染色并觀察。將石蠟切片，經(jīng)常規(guī)梯度酒精脫蠟和水洗后，采用檸檬酸鹽緩沖液抗原修復，PBS水洗3次，滴加山羊血清白蛋白37 ℃孵育15 min；PBS水洗3次，每張切片滴加50 μL兔源GPx5一抗(1∶400)，4 ℃孵育過夜；PBS水洗后進行避光操作，滴加熒光素Alexa Fluor 555標記鏈霉親和素(1∶500)孵育50 min；PBS水洗，滴加DAPI染色液(1∶800)孵育15 min；PBS水洗，抗熒光淬滅封片劑封片。采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0進行獨立樣本t檢驗分析，結果用“平均值±標準差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P≥0.05表示差異不顯著；采用Grandpad Primer 8.0作圖。

2 結果與分析

2.1 牦牛正常附睪和隱睪附睪的組織結構特點

由圖1可知：牦牛正常附睪被膜結構致密，基膜平整，附睪管發(fā)育良好，間質結締組織分布均勻，血管豐富，附睪上皮細胞排列整齊，管腔內(nèi)有大量精子；與正常附睪相比，隱睪組附睪基膜增厚內(nèi)陷，管腔縮小，上皮細胞排列不整齊，附睪管腔內(nèi)無精子形成，實質部分組織結構模糊，管周肌樣細胞減少，間質疏松，血管壁皺縮。由圖2可知：正常組附睪體和附睪尾的柱狀上皮厚度極顯著大于隱睪組(P<0.01)，附睪頭的柱狀上皮厚度顯著大于隱睪組(P<0.05)；正常組附睪體管腔內(nèi)徑顯著大于隱睪組(P<0.05)，附睪頭和附睪尾之間無顯著差異(P>0.05)；正常組附睪頭和附睪尾的纖毛長度極顯著大于隱睪組(P<0.01)，附睪體的纖毛長度顯著大于隱睪組(P<0.05)；正常組和隱睪組的附睪管腔外徑無顯著差異(P>0.05)。

圖1 牦牛正常附睪和隱睪附睪組織HE染色(1 000×)Fig.1 HE staining of normal epididymis and cryptorchidism epididymis of yak

圖2 牦牛正常附睪和隱睪附睪組織學指數(shù)特征Fig.2 Histologic parameters of normal epididymis and cryptorchidism epididymis of yak

2.2 GPx5在牦牛正常附睪和隱睪附睪的免疫組織化學分布比較

由圖3可知：GPx5在正常組附睪頭基細胞、附睪體主細胞和附睪尾管腔游離面強陽性表達，在附睪頭靜纖毛弱陽性表達；陰性對照組無陽性表達。隱睪附睪組織中，GPx5在附睪頭上皮細胞和靜纖毛、附睪體管腔游離面和管周肌樣細胞以及附睪尾管腔游離面呈強陽性表達；陰性對照組無陽性表達。由圖4可知：GPx5在正常附睪和隱睪附睪中的分布無顯著差異(P>0.05)。

圖3 GPx5在牦牛正常附睪和隱睪附睪免疫組織化學分布特點比較(1 000×)Fig.3 Comparison of GPx5 immunohistochemical distribution in normal and cryptorchidism epididymis of yaks

圖4 GPx5在牦牛正常附睪和隱睪附睪陽性信號積分光密度值Fig.4 Integrated optical density of positive signals of Gpx5 in normal epididymis and cryptorchidism epididymis of yak

2.3 GPx5 mRNA在正常附睪和隱睪附睪中的相對表達量比較

由圖5可知：GPx5mRNA在成年牦牛正常附睪頭和附睪體的表達量極顯著高于隱睪附睪(P<0.01)，附睪尾的相對表達量在兩者間無顯著差異(P>0.05)。

圖5 GPx5 mRNA在正常附睪和隱睪附睪中的相對表達量Fig.5 Relative expression levels of GPx5 mRNA in normal epididymis and cryptorchidism epididymis

2.4 GPx5蛋白在牦牛正常附睪和隱睪附睪的表達

由圖6可知：GPx5蛋白在牦牛正常附睪頭和附睪體的表達量明顯，在隱睪附睪頭和附睪體有少量表達；正常組附睪頭和附睪體的GPx5蛋白表達量極顯著高于隱睪組(P<0.01)，附睪尾的GPx5蛋白表達量在2組間無顯著差異(P>0.05)。

圖6 GPx5蛋白在牦牛正常附睪和隱睪附睪的表達Fig.6 Expression of GPx5 protein in normal and cryptorchidism epididymis of yak

2.5 GPx5在正常附睪和隱睪附睪組織中不同部位定位分析

由表2和圖7可知：GPx5在牦牛正常附睪和隱睪附睪的主細胞、基細胞、暈細胞、管周肌樣細胞及管腔纖毛均有不同強度表達。正常附睪中，GPx5在附睪頭基細胞和管周肌樣細胞均呈強陽性表達，在暈細胞偶有陽性表達，在精子、纖毛和血管管壁呈弱陽性表達；GPx5在附睪體管腔上皮基底部呈弱陽性表達；GPx5在附睪尾基細胞呈強陽性表達，在管周肌樣細胞呈中等強陽性表達，在血管內(nèi)皮細胞呈中等陽性表達。相較于正常組，GPx5在隱睪附睪頭主細胞無陽性表達，主要在上皮基底部、管周肌樣細胞及血管呈強陽性表達，暈細胞偶見陽性表達；GPx5在隱睪附睪體近管腔游離面和間質組織中小血管呈陽性表達，基底部弱陽性表達；GPx5在隱睪附睪尾血管壁呈強陽性表達，管周肌樣細胞偶見陽性表達，管腔游離面和基底部呈弱陽性表達。

圖7 GPx5在正常附睪和隱睪附睪組織中不同部位定位(200×)Fig.7 GPx5 localization in different parts of normal and cryptorchidism epididymis tissues

表2 GPx5在牦牛正常附睪和隱睪附睪組織中不同部位的分布密度Tab.2 Distribution density of GPx5 in different parts of normal and cryptorchidism epididymis of yak

3 討論

附睪是由睪丸輸出管和附睪管組成高度彎曲的管道，向后與輸精管連接，可分為附睪頭、附睪體和附睪尾。嚙齒動物在輸出管和附睪頭之間還有1個初始段[11]。附睪頭和附睪體分泌物與保持精子受精能力密切相關，附睪尾則對維持精子活力發(fā)揮著重要作用[12]。SULLIVAN等[13]發(fā)現(xiàn)：人附睪管腔直徑從附睪近端到遠端逐漸增大，近端上皮較厚，富含大量纖毛；附睪尾端膨大，上皮厚度減小，精子數(shù)量顯著增加，與低蛋白合成和分泌活性有關。體外研究證明：附睪管上皮細胞也參與精子細胞間信號傳遞[14]。隱睪附睪是由于睪丸異位未通過腹股溝管沿腹膜鞘突下降至陰囊內(nèi)，長時間停留在腹腔或腹股溝內(nèi)，高溫低氧環(huán)境使附睪局部組織受損[15]。實驗性小鼠隱睪癥表明：溫度升高對附睪尾功能有顯著影響[16]。本研究中，牦牛正常附睪頭至附睪尾上皮逐漸變薄，管腔上皮細胞結構完整，附睪管腔可貯存大量精子，管腔外圍結締組織豐富；與正常組相比，隱睪組附睪沒有精子貯存，間質內(nèi)膠原纖維增生，組織結構異常。隱睪附睪不適當?shù)男迯蜁鸩G丸及附睪實質與間質細胞腫瘤的發(fā)生[17]。本研究牦牛隱睪附睪小管基膜增厚內(nèi)陷，間質及管腔面積較正常組顯著增加，間質組織膠原纖維異常增生，提示隱睪附睪局部有纖維化的趨勢。

附睪特異表達的GPx5具有很強的過氧化物轉化能力[18]。有研究表明：GPx5基因在成年綿羊附睪頭的表達量極顯著高于附睪體和附睪尾，附睪體表達量顯著高于附睪尾[5]；GPx5基因主要在大鼠附睪頭表達，在附睪體和附睪尾弱表達[2]。本研究結果與之相似，即：GPx5基因在牦牛正常附睪頭、體、尾的表達逐漸減弱。GPx5作為附睪特異抗氧化劑，在附睪頭大量表達，能夠清除活性氧，使精子免受氧化損傷并維持受精能力。有研究報道：野生型雌性小鼠與GPx5基因缺失的雄性小鼠交配造成流產(chǎn)和胚胎缺陷，抗氧化酶缺失增加了精子的氧化應激[19]；NOBLANC等[20]研究表明：snGPx4和GPx5基因雙敲除小鼠表現(xiàn)出精核異常。本研究中，牦牛隱睪組GPx5基因在附睪頭和附睪體中的相對表達量極顯著低于正常組，但與正常組相比附睪尾表達無顯著差異，因此，隱睪主要影響附睪頭和附睪體GPx5分泌，影響局部微環(huán)境的抗氧化調節(jié)機制，這也是隱睪組附睪管腔無正常精子的原因之一。

GPx5蛋白主要由附睪頭上皮細胞合成，分泌到管腔與精子質膜結合，以還原性谷胱甘肽為底物，催化過氧化氫物和磷脂氫過氧化物，調節(jié)管腔微環(huán)境的ROS水平[21]。GPx5可促進精子成熟，使缺乏抗氧化酶的精子得到補償[22]。研究表明：GPx5在小鼠[2]、綿羊[5]和駱駝[6]等均以附睪頭為主要表達位置，從附睪頭到尾表達量逐漸下降。GPx5蛋白主要由附睪頭大量分泌并支持精子成熟；附睪尾端維持精子靜止狀態(tài)以保存能量，并在精子儲存過程中發(fā)揮作用[23]。與此相一致，本研究GPx5蛋白在正常附睪和隱睪附睪的表達結果與GPx5基因一致，正常附睪頭和附睪體極顯著高于隱睪附睪頭和附睪體，兩者尾部差異不顯著，提示GPx5蛋白對正常精子的產(chǎn)生發(fā)揮著重要作用，隱睪時GPx5蛋白表達下降可能會影響附睪的局部抗氧化機制。

附睪腔內(nèi)的假復層上皮由主細胞、基細胞、頂端細胞、暈細胞及管周肌樣細胞構成。TINGARI[24]研究發(fā)現(xiàn)：駱駝附睪上皮細胞主要由主細胞、基細胞、頂端細胞、暈細胞和暗細胞組成。不同動物附睪由于有獨特的上皮細胞類型和功能特點，其組織化學特征也有明顯差異[25]。主細胞是附睪蛋白分泌的主要來源[26]。研究發(fā)現(xiàn)：GPx5在附睪頭上皮細胞表達后分泌到附睪管腔，以補償未成熟精子抗氧化物酶的缺失，增加精子抗氧化能力，在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[27]。本研究中，牦牛正常組附睪頭主細胞、基細胞和管腔游離面均有GPx5表達，這與GPx5在駱駝附睪中的表達結果一致，提示在附睪頭上皮合成的GPx5通過靜纖毛分泌到管腔中，為精子運輸中免受氧化損傷和維持DNA的完整性調節(jié)局部微環(huán)境；但是，GPx5在隱睪附睪頭主細胞幾乎無表達，提示其在主細胞的表達缺失可能使精子抗氧化能力下降，不能正常發(fā)育。有研究報道：附睪體基細胞數(shù)量較多，而尾部較少，基細胞與相鄰主細胞相互作用介導細胞吞噬作用，調節(jié)電解質和運輸水分，維持上皮細胞穩(wěn)定性及其機械作用[28]。本研究中，正常附睪體基細胞GPx5呈強陽性表達，附睪尾有少量表達，表明其與主細胞高表達GPx5相互作用，吞噬細胞代謝產(chǎn)物，維持細胞間信號傳輸。隱睪附睪體基細胞數(shù)量減少，GPx5無陽性表達，提示隱睪時基細胞的正常發(fā)育受到影響，數(shù)量減少，抗氧化能力降低。暈細胞包括淋巴細胞、單核細胞和巨噬細胞等多種免疫細胞，在附睪頭、體和尾均有分布[29]。本研究中，暈細胞在正常附睪上皮基部以及附睪頭、體和尾均有分布，GPx5呈陽性表達；GPx5在隱睪附睪頭、體和尾的暈細胞均無陽性表達，提示隱睪暈細胞GPx5表達異?；蛴绊懜讲G免疫功能。頂端細胞保護腔內(nèi)精子免受氧化攻擊，胞質內(nèi)線粒體生成大量 ATP，在精子成熟過程以及細胞膜運輸 H+和 Cl-過程中發(fā)揮作用[30]。本研究中，頂端細胞在正常附睪管腔上皮均有分布，附睪尾部頂端細胞GPx5呈強陽性表達，表明頂端細胞可明顯影響附睪尾部管腔微環(huán)境調節(jié)。隱睪附睪頭、體和尾頂端細胞GPx5呈強陽性表達，提示隱睪時附睪頂端細胞對微環(huán)境的調節(jié)能力并未受到影響，其機理有待進一步研究。

4 結論

高原低氧環(huán)境下，牦牛隱睪附睪趨向纖維化；與正常組相比，GPx5在牦牛隱睪附睪頭及附睪體的表達顯著降低，影響局部微環(huán)境的抗氧化調節(jié)，且主要表現(xiàn)為主細胞及基細胞的表達缺失，提示其與精子氧化應激損傷及發(fā)育異常密切相關。