不同品種酸橙果皮和果肉中總黃酮含量的對比分析

施茂寅，朱靈芝，黃麗莉，王 峰

（1.江西省林業(yè)科技推廣和宣傳教育中心，江西 南昌 330038；2.江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；3.石藥集團(tuán)江西金芙蓉藥業(yè)股份有限公司，江西 九江 332707）

枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙（Citrus aurantium）及其栽培變種的未成熟果實，5－6 月收集自落的果稱為“枳實”，7－8 月收集的未成熟果稱為“枳殼”[1]。枳實味苦性涼，歸脾、胃經(jīng)，可健脾破氣并能消除積食、祛痰除痞；臨床上經(jīng)常與其他藥物配伍使用，治療胃下垂、食積消化停滯、便秘腹痛不良癥狀[2]。枳殼其辛、苦、酸，性寒，入肺、脾、大腸經(jīng)，為臨床常用的理氣藥，具有理氣寬中、行滯消脹等功效；主要用于治療胸脅氣滯、食積不化、高脂血癥等[3-6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，枳殼主要有胃腸道調(diào)節(jié)、抗抑郁、抗腫瘤、降血脂等功效，其功效主要與黃酮、生物堿、揮發(fā)油類等活性成分密切相關(guān)[7-11]。

枳殼主產(chǎn)于江西、四川、湖南、重慶、浙江等地，其中以江西枳殼的品質(zhì)為最佳，是江西省四大“道地藥材”之一[12]，習(xí)稱江枳殼。枳殼在江西主要品種為贛南香橙果系和贛南臭橙果系。目前對枳殼來源之一的酸橙，主要研究集中在未成熟果實中的化學(xué)成分分析及藥效實驗上。有研究表明，隨著酸橙果實的成熟，酸橙活性成分的含量呈現(xiàn)一定的變化[13]。

良種選育主要考察指標(biāo)之一是遺傳的穩(wěn)定性。目前對于酸橙的研究主要集中在未成熟果實上，考察的主要指標(biāo)成分之一是黃酮類，如新橙皮苷和柚皮苷[1]。將此時的指標(biāo)成分作為良種選育的數(shù)據(jù)有一定的不準(zhǔn)確性。因此研究成熟果活性物質(zhì)的含量變化對于酸橙的良種選育具有重要意義。

該實驗選用贛南香橙果系、贛南臭橙果系幾種酸橙成熟果作為實驗對象，對主要活性成分之一總黃酮含量進(jìn)行分析，以便為酸橙的良種選育提供一定的數(shù)據(jù)支撐。同時通過酸橙中非藥用部位（果肉）的黃酮含量分析將其變廢為寶，提高贛南香橙果系、贛南臭橙果系的附加值；從果品中分離提取出更多的功能性成分，開發(fā)成系列高附加值產(chǎn)品，這些產(chǎn)品不僅用于藥用，也可用于食品、保健品、化妝品等領(lǐng)域。因此，酸橙成熟果的黃酮類含量分析不僅有助于酸橙的質(zhì)量控制和良種選育。也可為酸橙成熟果中化學(xué)成分的開發(fā)、評價等方面提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司，批號：B20771，純度≥98%)；甲醇(分析純，西隴科學(xué)股份有限公司)；乙酸(AR，西隴化工股份有限公司)；亞硝酸鈉(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；三氯化鋁(AR，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；氫氧化鈉(AR，天津歐博凱化工有限公司)。實驗涉及其他試劑均為分析純。

實驗樣品共8 批（見表1），1 批酸橙未成熟果（枳殼）作為對照（YCR004），不同品種酸橙成熟果7 批，主要為贛南香橙果系和贛南臭橙果系，均于2021年采自江西道地產(chǎn)區(qū)新干縣黎山林場。

表1 不同酸橙品種信息Tab. 1 Information of different varieties of Citrus

1.2 儀器與設(shè)備

AL104 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司）；KQ-600DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；中藥粉碎機(jī)（永康市金穗機(jī)械制造廠）；ENXTN 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；E-3000 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA，OSB-2200）。

1.3 實驗方法

1.3.1 供試品溶液的制備

將8 個酸橙樣品用清水沖洗，晾干。分離果皮、果肉，用剪刀將果皮和果肉剪碎，置于烘箱中60℃干燥至恒重，粉碎，備用（樣品于室溫下密封避光保存）。

稱取上述各樣品5.0 g（精確到0.0001 g），置具塞錐形瓶中，加入15 mL 80%甲醇溶液，超聲提取1 h，冷卻，再稱重，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量。將所有提取液置于離心機(jī)，設(shè)置轉(zhuǎn)速為5000 r·min-1，溫度為4℃，離心時間為10 min，收集上清液，重復(fù)提取3 次，合并上清液至50 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶液定容。移取提取液1 mL 于5 mL 容量瓶中，加80%甲醇至刻度，即得。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（105℃烘至恒重）0.0101 g，用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為1000 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)母液后，逐級稀釋，分別配制質(zhì)量濃度為31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 和1000.00 mg·L-1的蘆丁系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.3 總黃酮含量測定

采用NaNO2-AlCl3-NaOH 顯色法。移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL 于10 mL 具塞干燥試管，加入0.1 mL 5% NaNO2和4 mL 水，搖勻，放置5 min 后，加入0.1 mL10%的AlCl3，放置6 min，加入3 mL 1 mol·L-1NaOH，混勻，10 min 后，分別取適量反應(yīng)后的溶液于比色皿中，在波長510 nm 處測定吸光度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與分析

酸橙果皮和果肉中總黃酮含量采用“1.3.3 項”下方法測得吸光度，平行3 份，取平均值。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)“1.3.3 項”下方法測量蘆丁的吸光度，結(jié)果如表2 所示，并根據(jù)表中數(shù)據(jù)作圖（圖1）。

表2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Tab. 2 Standard curve of rutin

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1 Standard curve of rutin

根據(jù)表2 作圖，利用最小二乘法作線性回歸方程，得到吸光度A 與蘆丁濃度C (mg·L-1)之間的關(guān)系式，即A=0.0004C+0.0303,其中相關(guān)系數(shù)R2=0.9916。表明本測定方法中蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和吸光度在所示范圍內(nèi)具有良好的線性相關(guān)性，故可作為總黃酮的測定方法。

2.2 精密度試驗

吸取125.00 mg·L-1蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.5 mL，一式6 份，按“1.3.3”項下測定方法進(jìn)行測定，在510 nm處測定吸光度，計算RSD值為1.67%，表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗

取XC002 的果皮粉末6 份，按“1.3.1”項下方法分別制備供試品溶液，按“1.3.3”項下測定方法分析，結(jié)果總黃酮平均含量為0.67%，計算出RSD為0.84%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

取XC002 的果皮粉末1 份，按“1.3.1”項下方法分別制備供試品溶液，分別于溶液制備后的0、2、4、6、8、12、24 h 后按“1.3.3”項下測定方法分析；計算出RSD為2.53%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 加樣回收率試驗

稱取已知含量的XC002 果皮粉末，分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液各3 mL，平行3 份，按“1.3.1”項下方法制備供試品溶液，按“1.3.3”項下測定方法分析測定，計算各成分的加樣回收率及RSD，結(jié)果見表3，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果Tab. 3 The results of recovery test

2.6 樣品含量測定

按“1.3.3”項下方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對同一品種而言（YCR004），未成熟果果皮和果肉中的黃酮含量均高于成熟果。不同品種成熟果酸橙果皮中總黃酮含量由高到低順序為：YTJ004＞YCR004＞ZX006＞有刺-4＞XC002＞有刺-6＞刺香橙，YTJ004 的果皮中總黃酮含量最高(1.72%)，刺香橙果皮中總黃酮含量最少(0.06%)；不同品種成熟果酸橙果肉中總黃酮含量由高到低順序為：有刺-6＞XC002＞YTJ004＞刺香橙＞YCR004＞ZX006＞有刺-4,有刺-6 果肉中總黃酮含量最高(1.08%)，有刺-4 果肉中總黃酮含量最少(0.10%)。

表4 酸橙果皮、果肉中總黃酮的含量Tab. 4 Content of total flavonoids in peel and pulp of Citrus

贛南臭橙果皮總黃酮含量為0.56%～1.17%，果肉含量為0.46%～1.08%；贛南香橙果皮總黃酮含量為0.06%～1.72%；果肉含量為0.40%～0.49%。

2.7 顯著性分析

利用SPSS 21.0 分析軟件進(jìn)行顯著性分析。結(jié)果見圖2，同一品種酸橙中，果皮、果肉中總黃酮的含量均有顯著性差異(P<0.05)。對不同品種酸橙而言，果皮、果肉中黃酮類化合物含量也有差異，部分品種之間差異性顯著(P<0.05)。除品種XC002、有刺-6、刺香橙外，其余酸橙樣品果皮中總黃酮含量均比果肉中總黃酮含量多；尤其是YTJ004 成熟果中，果皮總黃酮含量顯著高于其他品種。

圖2 酸橙果皮和果肉中總黃酮含量Fig. 2 Content of total flavonoids in peel and pulp of Citrus

3 結(jié)論與討論

實驗表明，總黃酮含量在不同品種的酸橙之間具有較大差異，部分品種之間差異性顯著(P<0.05)。對同一品種而言，不同采集時間的總黃酮含量差異也較大。且隨著酸橙果實的成熟，總黃酮含量呈現(xiàn)一定的下降趨勢。這與現(xiàn)有文獻(xiàn)報道相符合[14-15]。

黃酮類成分是酸橙植物中主要的成分之一，也是枳殼發(fā)揮理氣寬中等作用的的重要活性成分之一[14]。該實驗通過對不同品種酸橙成熟果總黃酮含量分析比較發(fā)現(xiàn)，同一品種酸橙中，果皮、果肉中總黃酮的含量均有顯著性差異(P<0.05)。不同品種酸橙中果皮、果肉中黃酮含量也有差異。酸橙果皮中總黃酮含量最高的品種為香橙系列的YTJ004，含量為1.72%，酸橙果肉中總黃酮含量最高的品種為臭橙系列的有刺-6，為1.08%。品種YTJ004、YCR004、有刺-4、ZX006 果皮中總黃酮的含量均高于果肉。酸橙主要入藥部位為皮，選擇果皮中總黃酮含量更高的品種可以作為優(yōu)良品種選育的數(shù)據(jù)來源之一。

通過比較酸橙成熟果中果皮和果肉的總黃酮含量發(fā)現(xiàn)，即使是成熟果，其黃酮含量依然較高，開發(fā)成熟果中黃酮的相關(guān)產(chǎn)品具有一定的理論可行性。后期可繼續(xù)對不同品種酸橙進(jìn)行研究，對其含有的黃酮類化合物進(jìn)行具體定性分析，為黃酮活性成分提供來源。