針刺對(duì)胃潰瘍大鼠胃黏膜損傷及MEK/ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

汪婧修,梁娟

(十堰市婦幼保健院,十堰 442000)

應(yīng)激性胃潰瘍(stress gastric ulcer,SGU)是機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下所出現(xiàn)的一種急性胃黏膜病變,臨床表現(xiàn)為胃底和胃體部黏膜表淺潰瘍、糜爛或出血[1]。其發(fā)病機(jī)制仍未完全明確,目前尚沒(méi)有針對(duì)性的治療藥物。近年來(lái),針灸對(duì)SGU的治療效果受到廣泛關(guān)注,針刺治療起效迅速,且具有副作用小,價(jià)格低廉的優(yōu)勢(shì),作為西藥的替代療法在SGU的臨床治療中發(fā)揮作用[2]?！昂夏寂溲ā睘镾GU治療的重要指導(dǎo)思想,足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴,胃腑的下合穴,中脘為胃之募穴,二者配合應(yīng)用能夠促進(jìn)胃黏膜愈合,減少潰瘍復(fù)發(fā),對(duì)SGU具有確切的臨床療效[3]。絲裂原活化蛋白激酶的激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MEK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)信號(hào)途徑能夠調(diào)控緊密連接蛋白表達(dá),對(duì)于胃黏膜的損傷與修復(fù)具有重要影響,與SGU的發(fā)生密切相關(guān)[4]。已有研究[5]表明,艾灸足三里和中脘穴能夠上調(diào)大鼠胃組織MEK/ERK通路蛋白的表達(dá),從而促進(jìn)脾虛證胃黏膜的修復(fù)。因此,本實(shí)驗(yàn)以MEK/ERK通路為研究指標(biāo),通過(guò)束縛-冷應(yīng)激法建立SGU大鼠模型,觀察針刺中脘、足三里對(duì)SGU的治療效果及其修復(fù)胃黏膜損傷的相關(guān)機(jī)制,同時(shí)設(shè)立針刺對(duì)照組,比較中脘、足三里“合募配穴”與針刺非經(jīng)穴的療效差異。

1 材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

58只SPF級(jí)雄性SD大鼠,體質(zhì)量(200±20)g,均購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018。飼養(yǎng)于室溫 18～25 ℃,相對(duì)濕度45%～55%環(huán)境中,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)十堰市婦幼保健院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò),實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用原則。

1.2 藥品及試劑

奧美拉唑腸溶片(20 mg/片)購(gòu)自阿斯利康制藥有限公司,表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA試劑盒(貨號(hào) ml003029)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor,TGF)-αELISA試劑盒(貨號(hào) ml002895)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司,總蛋白檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)QPBCA)購(gòu)自Sigama公司,AntipMEK(貨號(hào) ab96379)、Anti-pERK(貨號(hào) ab201015)、Anti-ZO-1(貨號(hào) ab190085)、Anti-Occludin(貨號(hào)ab216327)購(gòu)自美國(guó) Abcam公司,Anti-β-actin(貨號(hào)MAB8929)購(gòu)自美國(guó)R＆D公司。

1.3 模型制備

采用束縛-冷應(yīng)激法制備大鼠應(yīng)激性胃潰瘍模型[6]。大鼠造模前 24 h禁食不禁水,大鼠乙醚麻醉后仰臥束縛在鼠板上,將鼠板直立浸于溫度為20 ℃的水箱中,水平面與胸骨劍突部位齊平,水浸10 h后將鼠板取出,大鼠松綁。肉眼觀察大鼠胃黏膜充血、水腫、潮紅,胃體部出現(xiàn)數(shù)處斑點(diǎn)狀糜爛、潰瘍及出血,組織病理檢測(cè)見(jiàn)胃黏膜炎細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜缺損,為造模成功。

1.4 分組及干預(yù)

58只SD大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、針刺治療組、藥物對(duì)照組及針刺對(duì)照組,空白組10只,其余各組各12只。除空白組外,其余大鼠均采用WRS法制備SGU模型。造模過(guò)程中,各組大鼠均未見(jiàn)死亡情況,每組取2只大鼠驗(yàn)證模型成功后,針刺治療組參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]中大鼠常用針灸穴位定位取穴,于造模成功第2天取大鼠中脘(臍中上20 mm處)及雙側(cè)足三里(膝關(guān)節(jié)后外側(cè),腓骨小頭下5 mm處)給予針刺治療,每次30 min,每5 min捻轉(zhuǎn)行針30 s,每日1次,持續(xù)治療7 d。針刺對(duì)照組針刺中脘及足三里旁開(kāi)5 mm處非穴位對(duì)照點(diǎn),療程同針刺治療組。藥物對(duì)照組給予奧美拉唑腸溶片溶液0.2 mg/kg灌胃治療,每日1次,連續(xù)灌胃7 d。模型組固定于鼠板而不予針刺處理,每次30 min,每日1次。空白組正常喂養(yǎng),不予處理。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 胃黏膜損傷指數(shù)(ulcer index,UI)檢測(cè)

治療后,各組大鼠腹腔注射水合氯醛[400 mg/(kg·bw)]麻醉,腹主動(dòng)脈取血后結(jié)扎賁門(mén)和幽門(mén),向胃內(nèi)注射 10 mL生理鹽水,將全胃取出后,置于生理鹽水中再次固定 20 min。沿胃大彎剪開(kāi),沖洗胃內(nèi)容物后鋪平,立體顯微鏡下以目鏡測(cè)微尺測(cè)量胃黏膜損傷長(zhǎng)度。參照GUTH P H等[8]所制定的方法計(jì)算胃黏膜損傷指數(shù)(UI),斑點(diǎn)狀糜爛計(jì)1分;糜爛損傷長(zhǎng)度＜1 mm計(jì)2分;長(zhǎng)度1～2 mm計(jì)為3分;長(zhǎng)度＞2 mm且≤ 4 mm計(jì)為4分;長(zhǎng)度＞4 mm計(jì)為5分;當(dāng)寬度＞1 mm時(shí),計(jì)分按2倍計(jì)算,UI＝胃黏膜各處糜爛分值相加的總和。

1.5.2 胃黏膜組織形態(tài)學(xué)觀察

UI測(cè)量后,將大鼠胃組織于 10%多聚甲醛中固定48 h后取出,常規(guī)脫水、透明后進(jìn)行石蠟包埋,選取大鼠潰瘍明顯處作5 μm厚切片,再經(jīng)烘片、脫蠟至水、蘇木素-伊紅染色、70%鹽酸乙醇分化、脫水透明后用中性樹(shù)膠封片,光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠胃黏膜組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.5.3 血清中EGF、TGF-α含量檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各組大鼠血清中 EGF、TGF-α的含量。大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉,腹主動(dòng)脈取血,3 000 r/min離心后取血清,置于-20 ℃冰箱待測(cè)。血清于常溫下放置1 h后,3 000 r/min離心15 min,按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)要求配置標(biāo)準(zhǔn)品及試劑,加入樣品稀釋劑40 μL,抗體100 μL,血清10μL,37 ℃溫箱中孵育1 h,洗滌液清洗5次,加入顯色液100 μL,37 ℃避光孵育15 min,加入終止液50 μL,酶標(biāo)儀450 nm下檢測(cè)各組反應(yīng)孔OD值。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算各樣本EGF、TGF-α含量。

1.5.4 胃黏膜組織 pMEK、pERK及 ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)檢測(cè)

取大鼠胃黏膜組織100～200 mg,剪碎后置于裂解液中,使用組織勻漿器冰上勻漿,4 ℃離心機(jī)12 000 r/min離心20 min,提取總蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后,加入稀釋的pMEK、pERK、Occludin、β-actin(1:1 000)及ZO-1(1:500)一抗4 ℃孵育過(guò)夜,TBST洗膜,HRP標(biāo)記的二抗(1:5 000)37 ℃孵育1 h,TBST洗膜。ECL發(fā)光液孵育后,凝膠成像分析系統(tǒng)曝光圖像,計(jì)算目標(biāo)蛋白與相應(yīng)內(nèi)參的光密度比值,分析蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布,用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;多組間比較采用單因素方差分析;方差齊組間兩兩比較用 LSD檢驗(yàn),方差不齊則采用GamesHowell分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

空白組大鼠精神狀態(tài)良好,靈活喜動(dòng),攝食攝水及二便正常,毛發(fā)光澤柔順。造模操作后,模型組、針刺治療組、針刺對(duì)照組及藥物對(duì)照組大鼠均見(jiàn)精神不振,狀態(tài)萎靡,攝食攝水量較前明顯減少,體質(zhì)量下降,部分大鼠大便溏薄,毛色無(wú)光,容易脫落。隨著治療進(jìn)行,針刺治療組、藥物對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)逐漸改善,攝食攝水量及體質(zhì)量穩(wěn)定增加,毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤,便溏表現(xiàn)逐漸好轉(zhuǎn)。針刺對(duì)照組大鼠一般情況雖較模型組有所改善,但改變不及針刺治療組、藥物對(duì)照組明顯。

2.2 5組大鼠胃黏膜UI值比較

與空白組比較,模型組大鼠胃黏膜UI值明顯升高(P＜0.01)。與模型組比較,針刺治療組和藥物對(duì)照組大鼠胃黏膜 UI值明顯降低(P＜0.01),針刺對(duì)照組胃黏膜UI值雖較模型組有所降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。針刺治療組大鼠胃黏膜UI值明顯低于針刺對(duì)照組(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 5組大鼠胃黏膜UI值比較

2.3 5組大鼠胃黏膜形態(tài)學(xué)觀察

光鏡下可見(jiàn),空白組大鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)清晰,黏膜腺體排列規(guī)整,未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn);模型組大鼠與空白組比較胃黏膜損傷明顯,黏膜下層充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜上皮細(xì)胞壞死,可見(jiàn)深層黏膜破壞;經(jīng)治療后,針刺治療組與藥物治療組大鼠黏膜下層水腫明顯減輕,未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及黏膜組織破壞;針刺對(duì)照組大鼠黏膜下層可見(jiàn)輕度水腫和炎細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜上皮和深層破壞較模型組減輕。詳見(jiàn)圖2。

圖2 大鼠胃黏膜組織病理形態(tài)學(xué)改變

2.4 5組大鼠血清EGF、TGF-α含量比較

模型組大鼠血清EGF、TGF-α的含量較空白組明顯降低(P＜0.01)。與模型組比較,針刺治療組、藥物對(duì)照組血清 EGF、TGF-α的含量明顯升高(P＜0.05,P＜0.01)。針刺對(duì)照組大鼠血清中EGF、TGF-α含量較模型組有所升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。針刺治療組對(duì)血清EGF、TGF-α水平的改善明顯優(yōu)于針刺對(duì)照組(P＜0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 5組大鼠血清EGF、TGF-α含量比較 (±s,pg/mg)

表1 5組大鼠血清EGF、TGF-α含量比較 (±s,pg/mg)

注:與空白組比較 1)P＜0.01;與模型組比較 2)P＜0.05,3)P＜0.01;與針刺對(duì)照組比較4)P＜0.05

組別 n EGF TGF-α空白組 10 3.63±1.08 13.50±2.36模型組 10 0.68±0.541) 5.75±1.261)針刺治療組 10 1.59±0.851)2)4) 9.83±1.121)3)4)藥物對(duì)照組 10 1.62±0.891)2) 9.44±2.011)3)針刺對(duì)照組 10 0.92±0.461) 7.02±1.541)

2.5 5組大鼠胃黏膜組織pMEK、pERK蛋白水平比較

模型組大鼠胃黏膜組織中pMEK、pERK的蛋白表達(dá)較空白組顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較,針刺治療組、藥物對(duì)照組大鼠胃黏膜組織中pMEK、pERK的蛋白表達(dá)均明顯增高(P＜0.01)。針刺對(duì)照組的表達(dá)較模型組有所增高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。針刺治療組大鼠pMEK、pERK蛋白表達(dá)明顯高于針刺對(duì)照組(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖3。

圖3 5組大鼠胃黏膜組織中pMEK、pERK蛋白水平比較

2.6 5組大鼠胃黏膜組織ZO-1、Occludin蛋白水平比較

模型組大鼠胃黏膜組織中ZO-1、Occludin的蛋白表達(dá)較空白組明顯降低(P＜0.01)。針刺治療組、藥物對(duì)照組與模型組比較,ZO-1、Occludin的表達(dá)明顯升高(P＜0.01)。針刺對(duì)照組ZO-1、Occludin的表達(dá)較模型組有所升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。針刺治療組大鼠ZO-1、Occludin的蛋白表達(dá)明顯高于針刺對(duì)照組(P＜0.01)。詳見(jiàn)圖4。

圖4 5組大鼠胃黏膜組織ZO-1、Occludin蛋白水平比較

3 討論

應(yīng)激性胃潰瘍(stress gastric ulcer,SGU)是指機(jī)體在創(chuàng)傷、燒傷、休克、寒冷等各種應(yīng)激狀態(tài)下所出現(xiàn)的一種急性胃黏膜病變,臨床一般表現(xiàn)為胃底和胃體部黏膜表淺潰瘍、糜爛或出血[1]。隨著經(jīng)濟(jì)、科技水平不斷提高,人們的心理壓力逐漸增大,導(dǎo)致 SGU的發(fā)病率逐年增長(zhǎng)。如今,奧美拉唑等質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)已廣泛應(yīng)用于SGU的治療,但長(zhǎng)期服用PPIs可導(dǎo)致胃黏膜屏障功能受損,腸道菌群紊亂等不良反應(yīng),還能影響維生素C、維生素B12的吸收,增加胃癌與血液相關(guān)疾病的發(fā)病幾率[9]。近年來(lái),針刺及電針經(jīng)大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),治療 SGU療效確切,且具有經(jīng)濟(jì)、毒副作用小的優(yōu)勢(shì)[2]。

將六腑的下合穴與本經(jīng)募穴配合使用,以治療六腑病證的配穴方法稱(chēng)為“合募配穴”[10]。下合穴主治內(nèi)腑,偏于通降,募穴亦偏重于內(nèi)腑或陽(yáng)經(jīng)病邪,合募配合,可起到升降相合,調(diào)暢氣機(jī)的作用?！秲?nèi)經(jīng)》中首次提出“合治內(nèi)腑”,《難經(jīng)·六十七難》提出“陽(yáng)病行陰,故令募在陰”的理論,使“合募配穴”成為針灸治療腑病的重要指導(dǎo)思想[11]。足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴,胃腑的下合穴,為治療胃腑疾患的首選穴。中脘為胃之募穴,亦善治臟腑病變。中脘及足三里配合能夠促進(jìn)胃氣生成及運(yùn)行,調(diào)理中焦,調(diào)暢氣機(jī)及運(yùn)脾化濕,治療SGU臨床應(yīng)用廣泛,療效顯著[12]。徐小茹等[13]分析總結(jié)了近10年針灸治療SGU的取穴規(guī)律,發(fā)現(xiàn)取穴以四肢部位為主,以胸腹部為輔,其中足三里與中脘合募配穴的應(yīng)用頻次占54.54%。

經(jīng)穴主治的特異性是針刺療法應(yīng)用的依據(jù)和基礎(chǔ),也是其發(fā)揮療效的關(guān)鍵因素。人體的主要穴位區(qū)微血管、神經(jīng)分支豐富,多沿經(jīng)脈循行走行。針刺刺激經(jīng)穴與非穴區(qū),作用有明顯差異[14]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)束縛-冷應(yīng)激法制備大鼠 SGU模型,觀察中脘、足三里“合募配穴”對(duì)SGU的治療作用,并設(shè)立針刺對(duì)照組,觀察針刺經(jīng)穴與非經(jīng)穴的療效差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出,中脘、足三里針刺治療能夠降低 UI值,改善大鼠胃黏膜損傷,且治療效果明顯優(yōu)于針刺對(duì)照組。提示中脘、足三里配合能夠促進(jìn) SGU損傷胃黏膜的修復(fù),其經(jīng)穴效應(yīng)具有特異性。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是一種單鏈多肽物質(zhì),廣泛分布于人體多種組織,具有抑制胃酸分泌,促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的作用,并能保護(hù)胃黏膜免受損傷因子的破壞[15]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α(TGF-α)是EGF家族中的一種具有調(diào)節(jié)胃黏膜損傷后修復(fù)作用的主要調(diào)節(jié)肽,能夠通過(guò)自分泌促進(jìn)上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞的有絲分裂,調(diào)節(jié)壁細(xì)胞酸分泌功能,維持胃黏膜完整性[16]。本實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠血清EGF和TGF-α水平最低,針刺治療組大鼠EGF、TGF-α的水平隨其癥狀的改善而明顯升高,提示針刺中脘、足三里能夠促進(jìn)SGU大鼠內(nèi)源性 EGF、TGF-α的合成與釋放,參與胃黏膜細(xì)胞增殖及黏膜結(jié)構(gòu)的重建,從而促進(jìn)SGU愈合。

另一方面,EGF和TGF-α通過(guò)與表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)相互作用,能引起兩個(gè)及多個(gè)受體聚集,使酪氨酸激酶活化,激活絲裂原活化蛋白激酶(MEK)/胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)途徑[17]?；罨腗EK/ERK可調(diào)節(jié)胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,參與胃炎、胃潰瘍的發(fā)生,及胃黏膜的防御與修復(fù)過(guò)程[18]。本實(shí)驗(yàn)選擇MEK/ERK通路作為研究指標(biāo),觀察針刺中脘、足三里對(duì)其相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控作用。結(jié)果可見(jiàn),與模型組比較,針刺治療組可顯著上調(diào)大鼠胃黏膜pMEK和pERK的表達(dá),提示針刺中脘、足三里參與SGU胃黏膜修復(fù)的機(jī)制可能與激活MEK/ERK通路相關(guān)。此外,MEK/ERK通路可通過(guò)調(diào)節(jié)閉合蛋白(Occludin)和緊密粘連蛋白-1(ZO-1)的表達(dá)來(lái)維持胃黏膜緊密連接,恢復(fù)胃黏膜屏障功能[19]。研究[20]表明,ERK特異性抑制劑干預(yù)后,pERK的表達(dá)降低,ZO-1的表達(dá)隨之降低。MEK/ERK信號(hào)通路激活,則 ZO-1的表達(dá)增加,從而促進(jìn)了胃黏膜的修復(fù)。YANG R等[21]發(fā)現(xiàn),阻斷ERK1/2的磷酸化進(jìn)程,則ZO-1、Occludin的表達(dá)顯著下調(diào)。機(jī)體在應(yīng)激狀態(tài)下,胃黏膜屏障功能受到破壞,細(xì)胞間緊密連接結(jié)構(gòu)受損,細(xì)胞間通透性增加,導(dǎo)致胃黏膜損傷[21]。在本實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠胃黏膜ZO-1和Occludin的表達(dá)均明顯降低,提示胃黏膜上皮屏障功能損傷,黏膜防御功能下降。中脘、足三里針刺治療顯著增加了 ZO-1和Occludin的表達(dá),從而使大鼠胃黏膜屏障功能得到有效恢復(fù),減輕了黏膜病理?yè)p傷,與病理染色結(jié)果一致。針刺治療組對(duì)以上指標(biāo)的改善效果均優(yōu)于針刺對(duì)照組,同樣說(shuō)明了中脘、足三里經(jīng)穴效應(yīng)的特異性。

綜上所述,中脘、足三里“合募配穴”治療 SGU療效明確,其機(jī)制可能與激活MEK/ERK信號(hào)通路,促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)因子及緊密連接蛋白的表達(dá)相關(guān)。