復(fù)方益腎利石顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

覃新華，胡傳義，陳娟

（第二軍醫(yī)大學(xué)附屬上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院，上海 200135）

0 引言

復(fù)方益腎利石湯是上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院長期院內(nèi)經(jīng)驗(yàn)方，由海金沙、金錢草、生雞金、石葦、車前子、川斷、杜仲、枳殼、炒蒲黃9個(gè)藥味組成，具有清熱利濕、理氣排石、益腎止血的功效[1-2]，用于泌尿系結(jié)石的輔助治療，經(jīng)長期用藥觀察，能顯著降低術(shù)后腎損傷、結(jié)石殘留率和并發(fā)癥的發(fā)生率。為使更多患者受益，擬將該方開發(fā)為院內(nèi)制劑“復(fù)方益腎利石顆?！薄?/p>

為確保復(fù)方益腎利石顆粒臨床用藥的安全性和有效性，保證產(chǎn)品質(zhì)量，本研究參照2020年版《中國藥典》（一部）中藥材的相關(guān)規(guī)定對所研制的復(fù)方益腎利石顆粒中枳殼進(jìn)行了TLC 定性鑒別，采用 HPLC 法測定柚皮苷、新橙皮苷的含量，采用紫外-可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計(jì)）的含量[3]，為復(fù)方益腎利石顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CAT-022.7808薄層色譜全自動(dòng)點(diǎn)樣儀（CAMAG公司，瑞士）；UV-2450薄層色譜全自動(dòng)攝像儀（CAMAG公司，瑞士）；Agilent1200高效液相色譜儀（安捷倫公司，美國）；UV-2102PCS紫外-可見分光光度計(jì)(尤尼柯公司，上海)；DK-S26六孔水浴鍋（精宏公司，上海）；XS105十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司，上海）。

1.2 試藥

復(fù)方益腎利石顆粒（批號：2020072901、2020072902、2020072903）由上海中藥制藥技術(shù)研究中心自制；川續(xù)斷皂苷Ⅵ、柚皮苷、新橙皮苷對照品均來源于中國食品藥品檢定研究院(批號分別為：39524-08-8、110722-201815、111857-201804)；硅膠G薄層板（MERCK， Lot: HX73381626）；乙腈、甲醇為色譜純（默克公司，上海）；磷酸（賽默飛世爾公司，中國）；超純水（屈臣氏公司，廣州）。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 續(xù)斷的TCL鑒別

續(xù)斷中的主要化學(xué)成分為川續(xù)斷皂苷Ⅵ[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，對照藥材陰性樣品存在干擾，因此，采用川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品進(jìn)行鑒別。（1）供試品溶液制備：取本品細(xì)粉0.2g（批號：2020072901），加甲醇15mL，超聲處理30min，濾過，水浴蒸干，殘?jiān)蛹状?mL，使溶解。（2）對照品溶液的制備：再取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品，加甲醇制成每1mL含lmg的對照品溶液。（3）陰性樣品的制備：取缺續(xù)斷的處方藥材制備陰性樣品，按供試品溶液制備的方法制成陰性樣品溶液。（4）檢查方法：按照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)[5]，吸取上述4種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

結(jié)果顯示，樣品與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖1。

2.1.2 枳殼的TCL鑒別

枳殼中的主要化學(xué)成分為柚皮苷和新橙皮苷[6]。（1）供試品溶液制備：取本品細(xì)粉0.2g（批號：2020072901），加甲醇10mL，超聲處理30min，濾過，取濾液，水浴蒸干，加入5mL甲醇，使殘?jiān)芙?，得供試品溶液。?）對照藥材溶液的制備：以枳殼為對照藥材，同上配制成對照藥材溶液；（3）對照品溶液的制備：分別取柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品，加入甲醇，得每1mL各含 0.5Mg的對照品溶液;（4）檢查方法：按照薄層色譜法（《中國藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)[5]，取硅膠G薄層板1塊，分別點(diǎn)于上述供試品溶液各10μL、對照品溶液20μL，制備展開劑，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ：6 ：2）的上層液，展開，取出，晾干，噴以3%三氯化鋁乙醇溶液，置105℃恒溫箱中，加熱5min，使用365nm紫外光燈照射下觀察。

結(jié)果顯示，樣品與枳殼對照藥材、柚皮苷和新橙皮苷對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同的斑點(diǎn)，且陰性樣品無干擾。結(jié)果見圖2。

圖2 枳殼的薄層色譜圖

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 溶液的制備

對照品溶液的配制：取蘆丁對照品25mg置50mL量瓶中，加30%乙醇適量，超聲使溶解，放冷，加30%乙醇至刻度，搖勻。精密量取10mL置50mL量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的配制：取本品細(xì)粉1g（批號：2020072901），置具塞錐形瓶中，加30%乙醇25mL，密塞，稱定重量，加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。取續(xù)濾液5mL，置50mL量瓶中，加30%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 線性關(guān)系考察

參照相關(guān)文獻(xiàn)[7-9]，精密吸取對照品溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分別置10mL量瓶中，加30%乙醇5mL起制備成系列標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，制成總黃酮濃度為：0.099mg/mL、0.198mg/mL、0.297mg/mL、0.396mg/mL、0.495mg/mL的對照品溶液，于510nm波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（y），以濃度為橫坐標(biāo)（x），繪制回歸曲線。結(jié)果總黃酮的回歸方程為Y=1.3212X-0.0022（R2=0.9999），表明總黃酮在0.099～0.495mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液3mL，于510nm波長處連續(xù)測定6次。結(jié)果吸光度的RSD=0.16%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液1mL置10mL量瓶中，依次在510nm波長下，分別測定0h、0.5h、1h、1.5h、2h、3h時(shí)間點(diǎn)溶液的吸光度。結(jié)果，總黃酮含量的RSD=0.43%（n=6），表明供試品溶液在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

同批號的樣品取6份，參照“2.2.1”項(xiàng)方式制備供試品溶液。依次在510nm波長處進(jìn)行測定，結(jié)果吸光度的RSD=1.49%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱定已知總黃酮含量的供試品溶液9份（批 號：2020092301、2020092302、2020092303），加入蘆丁對照品，參照“2.2.1”項(xiàng)下方式制備供試品溶液。于510nm波長處進(jìn)行測定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，總黃酮平均回收率為98.37%，（RSD=0.01%，n=9），表明該方法具有良好的加樣回收率，見表1。

表1 總黃酮含量測定回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.7 樣品含量測定

取3批樣品（批號：2020092301、2020092302、2020092303）各1g，參照“2.2.1”項(xiàng)下方式制備供試品溶液，在510nm波長處測定，平行測定3次，讀取吸光度，計(jì)算樣品中總黃酮（以蘆丁計(jì)）的含量。為了確保產(chǎn)品質(zhì)量，采用平均值的80%作為含量的下限，因此，本品含總黃酮以蘆丁計(jì)不得少于6.0mg/g。結(jié)果詳見表2。

表2 樣品中總黃酮含量的測定結(jié)果

2.3 柚皮苷、新橙皮苷含量測定

2.3.1 色譜條件[10-11]

高效液相儀Agilent 1200，MWD檢測器，Agilent 1200工 作 站；色 譜 柱：SyMMetry C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：以乙腈-水（20:80）（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3）；檢測波長：283nm；柱溫：30℃。

2.3.2 溶液制備

2.3.2.1 對照品儲備溶液的制備

分別取柚皮苷對照品、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每lmL含柚皮苷1.0mg和每lmL含新橙皮苷0.5mg的儲備液。取上述對照品儲備液，加入稀釋液到刻度，輕搖勻，制配混合對照品溶液為每1mL含柚皮苷和新橙皮苷各80μg。

2.3.2.2 供試品溶液的制備

稱取本品粗粉0.2g（批號：2020072901），置錐形瓶中，加入50mL甲醇，稱定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱定重量，加入甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液10mL，置25mL量瓶中，加入甲醇直至刻度，搖勻，即得。

2.3.2.3 陰性對照溶液的制備

取缺柚皮苷、新橙皮苷的陰性樣品0.2g，參照“2.3.2.2”方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.3.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μL，分別注入液相色譜儀。結(jié)果如圖3。

圖3 柚皮苷、新橙皮苷專屬性考察

2.3.3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取對照品溶液適量，分別制成柚皮苷濃 度 為0.042、0.079、0.115、0.157、0.205、0.252、0.288mg/mL與 新 橙 皮 苷 濃 度 為0.010、0.031、0.051、0.079、0.109、0.140、0.165mg/mL的 對 照 品溶液，準(zhǔn)確吸取上述對照品溶液10μL，按上述確定的色譜條件進(jìn)行測定，分別以對照品進(jìn)樣濃度的對數(shù)（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的對數(shù)值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到線性回歸方程及線性范圍。結(jié)果柚皮苷的回歸方程為Y=17913X-56.038（R2=0.9991），表明柚皮苷在0.042～0.288mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;新橙皮苷的回歸方程為Y=A=19646X-82.457（R2=0.9999），表明新橙皮苷在0.010～0.165mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。測定柚皮苷、新橙皮苷峰面積峰面積RSD均小于3%，表明儀器的精密度良好。

2.3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液1份，分別于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h進(jìn)樣，測得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD分別為0.16%和0.19%，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液6份，精密吸取注入液相色譜儀測定，測得柚皮苷、新橙皮苷峰面積RSD均小于2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱取已知柚皮苷、新橙皮苷含量的供試品9份（批號：2020092301、2020092302、2020092303），分別加入對照品溶液。分別精密吸取供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，計(jì)算平均加樣回收率和RSD。結(jié)果顯示柚皮苷的平均加樣回收率在99.79%-104.11%，新橙皮苷的平均加樣回收率在96.35%-103.15%，RSD均小于3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度高。結(jié)果詳見表3、表4。

表3 柚皮苷加樣回收率

表4 新橙皮苷加樣回收率

2.3.3.7 樣品中柚皮苷、新橙皮苷含量測定

取3批樣品（批號：2020072901、2020072902、2020072903）各1g，研磨細(xì)粉，按“2.3.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，對3批樣品中柚皮苷、新橙皮苷進(jìn)行含量測定，每批樣品平行制備兩份，取平均值，結(jié)果詳見表5。

表5 柚皮苷、新橙皮苷含量檢測

3 討論

尿路結(jié)石是泌尿外科的常見病，其發(fā)病率高，癥狀及并發(fā)癥復(fù)雜，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和身體健康[12-13]。近年來，中醫(yī)藥在促進(jìn)結(jié)石排出、減少血尿及保護(hù)腎臟功能方面有獨(dú)特優(yōu)勢，能夠減少手術(shù)對腎臟的損傷，提高手術(shù)成功率，減少并發(fā)癥，為眾多尿路結(jié)石患者所接受與肯定[14]。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，復(fù)方益腎利石顆粒具有利尿通淋、益陽補(bǔ)腎、行氣止痛、護(hù)腎、排石等作用。近幾年來，復(fù)方顆粒等現(xiàn)代中藥用藥形式的出現(xiàn)，具有服用量小、易攜帶、易保存等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)中藥的缺點(diǎn)[15-16]。復(fù)方益腎利石顆粒保持了益腎利石湯的功效與性味，具有使用方便、劑量準(zhǔn)確、吸收迅速、安全清潔等優(yōu)點(diǎn)[17-18]；但目前尚未建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。因此，本研究采用TCL法對顆粒進(jìn)行定性鑒別，采用紫外可見分光光度法測定顆粒中總黃酮含量，采用HPLC法測定顆粒中柚皮苷、新橙皮苷的含量。

TLC法是中藥材定性鑒別的主要方法，能快速分離、定性分析少量物質(zhì)，在中藥成方制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究中具有重要的地位[19]。參考 2020 年版《中國藥典》（一部）[20]及相關(guān)文獻(xiàn)[21-22]，本研究在預(yù)試驗(yàn)中對復(fù)方益腎利石顆粒中 9 個(gè)藥味的主要活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，續(xù)斷、枳殼的TLC鑒別專屬性強(qiáng)、色譜斑點(diǎn)清晰、分離度好、無拖尾現(xiàn)象，可用于定性鑒別，其它藥味暫未找到合適的薄層鑒別方法。

在含量指標(biāo)成分選擇方面，復(fù)方益腎利石顆粒方劑中的主要有效成分為皂苷、黃酮苷類、環(huán)烯醚萜苷類，成分多且復(fù)雜，適宜應(yīng)用多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合評價(jià)的方式，以達(dá)到控制顆粒質(zhì)量的目的[23]。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中，槲皮素、山奈素為君藥金錢草的主要活性成份之一，其含量本應(yīng)作為質(zhì)量控制指標(biāo)。但經(jīng)HPLC分析，分別制備本方9個(gè)藥味的單味藥水提取樣品，僅在雞內(nèi)金和車前子中沒有檢測到槲皮素和山奈素，說明其余7個(gè)藥味中均含有槲皮素和山奈素成分，因此無法對槲皮素和山奈酚進(jìn)行專屬性考察和轉(zhuǎn)移率分析。而經(jīng)查閱相關(guān)文獻(xiàn)[24-27]，發(fā)現(xiàn)該制劑中海金沙、金錢草、石葦、川斷、杜仲、枳殼、炒蒲黃等藥材中均富含黃酮類化合物，其對排石、益腎亦有不同程度的作用，故本研究采用紫外可見分光光度法測定總黃酮（以蘆丁計(jì)）含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)；同時(shí)，根據(jù)前期對提取預(yù)實(shí)驗(yàn)及提取工藝、制劑研究過程對中間體的含量檢測結(jié)果，選擇顆粒劑中含量較高的柚皮苷、新橙皮苷為含量檢測指標(biāo)，并對含量指標(biāo)測定進(jìn)行了方法學(xué)考察，結(jié)果表明線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率均符合規(guī)定。

綜上所述，復(fù)方益腎利石顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用多指標(biāo)綜合評價(jià)[28]，比單一指標(biāo)評價(jià)更全面、準(zhǔn)確，能為復(fù)方益腎利石顆粒質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。