基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討干姜黃芩黃連人參湯改善2型糖尿病胰島素抵抗的作用機(jī)制

彭智平 張琳琳

國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)糖尿病地圖集顯示，全球約有4.63 億糖尿病患者，中國(guó)糖尿病患者約為1.16億，占全球糖尿病患者總數(shù)的1/3[1]，其中糖尿病不同類(lèi)型中又以2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）為主。胰島素抵抗是T2DM 的主要發(fā)病機(jī)制之一，而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)具有多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的特點(diǎn)，對(duì)改善胰島素抵抗具有較大的優(yōu)勢(shì)[2-3]。干姜黃芩黃連人參湯屬于經(jīng)典名方，前期研究與文獻(xiàn)報(bào)道已明確該方可改善胰島素抵抗[4]，然而其機(jī)制未有進(jìn)一步闡釋。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是采用多種數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)絡(luò)分析藥物、成分、疾病與靶點(diǎn)之間關(guān)系的藥理學(xué)分支學(xué)科，可以在一定程度上提示藥物對(duì)疾病的作用機(jī)制，故本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析干姜黃芩黃連人參湯干預(yù)的機(jī)理，為該方下一步深入基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供依據(jù)[5-6]。

1 材料與方法

1.1 干姜黃芩黃連人參湯藥物活性成分與靶點(diǎn)篩選借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)[7]（traditional Chinese medicine systems pharmacology atabase and analysis platform，TCMSP），根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的2 個(gè)ADME [“吸收（absorption）、分布（distribution）、代謝（metabolism）和外排（excretion）”的簡(jiǎn)稱(chēng)]屬性值進(jìn)行藥物主要活性成分篩選，以及藥物活性成分作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并在Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org）規(guī)范靶點(diǎn)基因[8]。

1.2 T2DM 基因靶點(diǎn)的篩選 采用常用的OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.omim.org）、DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.drugbank.ca）、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org）等，其中Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中分?jǐn)?shù)（Score）越高表示與疾病關(guān)系越緊密，T2DM 在該數(shù)據(jù)中由于靶點(diǎn)較多，故根據(jù)目標(biāo)靶點(diǎn)多次取大于中位數(shù)的基因靶點(diǎn)為疾病潛在靶點(diǎn)，然后合并3 個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)基因靶點(diǎn)，最后刪除重復(fù)基因靶點(diǎn)即為T(mén)2DM 對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)。

1.3 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 靶點(diǎn)蛋白互作（protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 根據(jù)干姜黃芩黃連人參湯藥物成分基因靶點(diǎn)與T2DM 基因靶點(diǎn)取交集，兩組基因靶點(diǎn)繪制韋恩圖，篩選出重疊基因，利用String11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org）構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，將生物種類(lèi)設(shè)定為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.4），其余設(shè)置均為默認(rèn)設(shè)置，得到PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.4 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)的篩選 運(yùn)用CytoScape3.7.1 軟件構(gòu)建干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 交集基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，利用CytoScape3.7.1 內(nèi)置工具分析交集靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，根據(jù)節(jié)點(diǎn)之間屬性值，包括連接度（degree）、介度（betweenness）及緊密度（combined score）等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)節(jié)點(diǎn)大小、顏色及粗細(xì)判斷核心靶點(diǎn)。

1.5 生物信息分析 應(yīng)用Metascape 平臺(tái)（http://metascape.org/gp/index.html）的數(shù)據(jù)資料[9]，將干姜黃芩黃連人參湯治療T2DM 的靶點(diǎn)錄入Metascape 平臺(tái)，物種設(shè)置為H.sapiens，然后進(jìn)行個(gè)性分析，P＜0.01，從而得到其生物學(xué)過(guò)程與通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 干姜黃芩黃連人參湯活性成分靶點(diǎn)的獲取 分析得到干姜黃芩黃連人參湯方中主要含有81 個(gè)活性成分（干姜5 個(gè)，黃連14 個(gè)，黃芩36 個(gè)，西洋參11個(gè)，知母15 個(gè)），其中重復(fù)值采用統(tǒng)一代號(hào)命名，共得到60 種候選化合物。干姜含有姜辣素等，對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)有PIK3CG、KCNH2、DRD1、CHRM3、CHRM1、SCN5A、GABRA2、CHRM4、PDE3A、HTR2A等；黃芩的主要成分含有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等，對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)有NOS2、PTGS1、AR、PTGS2、DPP4、PRSS1、NCOA2、PIK3CG、CHEK1、ADRB2、PDE3A、RELA、BCL2、CDKN1A 等100 多種；黃連的主要成分含有黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀等，對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)有PIK3CG、NCOA2、DPP4ERBB2、PPARG、ACACA、HMOX1、CYP3A4、CYP1A2 等100多種；西洋參含有人參皂苷Rg、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1 等，對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)有PTGS2、PGR、NR3C2、NCOA2、PTGS1、PTGS2、PIK3CG、KCNH2 等；知母含有芒果苷、知母皂苷B 等，對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)有CHRM1、ADRB1、SCN5A、HTR2A、ADRA1A、CHRM2、ADRA1B、GABRA1 等。該方的藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。

圖1 藥物、成分與基因靶點(diǎn)圖

2.2 T2DM 基因靶點(diǎn)的獲取 根據(jù)T2DM 基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選，從OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取508 個(gè)基因靶點(diǎn)，DrugBank 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取101 個(gè)基因靶點(diǎn)，Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取1537 個(gè)基因靶點(diǎn)。由于Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)中原始靶點(diǎn)基因較多，根據(jù)篩選靶點(diǎn)基因目標(biāo)，設(shè)定Score 大于中位數(shù)的目標(biāo)靶點(diǎn)為T(mén)2DM 的潛在靶點(diǎn)，并且按照此方法進(jìn)行多次篩選，共篩選出1537 個(gè)基因靶點(diǎn)為T(mén)2DM 的潛在靶點(diǎn)。把OMIM、DRUGBANK、Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)合并后刪除重復(fù)值，最終得到2062 個(gè)T2DM 的基因靶點(diǎn)。

2.3 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 通過(guò)篩選干姜黃芩黃連人參湯藥物活性成分靶點(diǎn)與T2DM 疾病靶點(diǎn)取交集，并繪制韋恩圖，得到干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 共同靶點(diǎn)148 個(gè)（見(jiàn)圖2），具體如下：XDH、VEGFA、VCAM1、TP53、TNF、THBD、TGFB1、STAT1、SPP1、SOD1 等。進(jìn)而將靶點(diǎn)提交至STRING11.0 平臺(tái)，得到干姜黃芩黃連人參湯靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖3）。

圖2 成分靶點(diǎn)圖與疾病靶點(diǎn)圖

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM 網(wǎng)絡(luò)圖中核心靶點(diǎn)的獲取 運(yùn)用CytoScape3.7.1 軟件構(gòu)建干姜黃芩黃連人參湯成分與T2DM-交集基因靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)，利用String11.0 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取string_interactions.tsv 插件，然后把該插件導(dǎo)入CytoScape3.7.1 軟件（見(jiàn)圖4）。通過(guò)CytoScape3.7.1 內(nèi)置的NetworkAnalyzer分析干姜黃芩黃連人參湯治療T2DM 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，得到核心作用靶點(diǎn)：TNF、IL-6、TP53、CASP3、IL-10、MAPK1、AKT1、VEGFA、MMP9、EGFR1、MYC、PTGS2、MAPK8、EGF、IL-1β 等。

圖4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)互作圖

發(fā)現(xiàn)在該關(guān)鍵靶點(diǎn)信息中免疫炎癥基因靶點(diǎn)較多，故而進(jìn)一步提取了這些節(jié)點(diǎn)相互作用關(guān)系進(jìn)行分析，得到了PPI 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖中IL-6、IL-10、IL-1β、TNF等基因靶點(diǎn)PPI 網(wǎng)絡(luò)互作圖中相互作用（見(jiàn)圖5）。

圖5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)互作圖關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)之一

2.5 交集基因靶點(diǎn)基因本體（gene ontology，GO）生物功能與京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 應(yīng)用Metascape 數(shù)據(jù)平臺(tái)對(duì)干姜黃芩黃連人參湯治療T2DM 相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)通路分析，得出干姜黃芩黃連人參湯主要參與的生物學(xué)過(guò)程與富集通路包括AGE-RAGE 信號(hào)通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、NF-κB 信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、JAK-STAT 信號(hào)通路（Jak-STAT signaling pathway）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、IL-17 信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、Toll 樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、HIF-1 信號(hào)通路（HIF-1 signaling pathway）等多種信號(hào)通路干預(yù)T2DM。

3 討論

干姜黃芩黃連人參湯出自《傷寒論·厥陰病篇》，原方由黃芩、黃連、人參、干姜四味藥組成，后經(jīng)筆者導(dǎo)師仝小林教授化裁以西洋參易人參，并加入知母，在臨床干預(yù)T2DM 中具有較好療效。從方中藥物分析可知，黃芩、黃連苦寒清胃熱，佐以干姜辛溫散寒以防芩連過(guò)于苦寒傷胃，藥物寒熱配伍使胃熱得清而不傷胃，辛開(kāi)苦降合用而有利于中焦脾胃升清降濁、斡旋氣機(jī)，西洋參甘溫扶脾補(bǔ)益中氣，全方共奏清胃熱健脾益氣之功，符合“消癉”的脾虛胃熱型病機(jī)特點(diǎn)[10-12]。而T2DM 屬中醫(yī)中醫(yī)“消癉”范疇，仝小林院士提出糖尿病的自然發(fā)展進(jìn)程其中之一即為“消癉”—消渴—消渴并發(fā)癥，其中“消癉”的病位在脾胃，核心病機(jī)為脾虛胃熱，治宜清胃健脾，該治則符合干姜黃芩黃連人參湯的核心病機(jī)[13]。且前期研究也已表明，干姜黃芩黃連人參湯可改善胰島素抵抗，為進(jìn)一步探索該方的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，剖析了干姜黃芩黃連人參湯改善胰島素抵抗的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)與可能作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出干姜黃芩黃連人參湯60 種活性成分，包含有黃芩苷、黃芩素、黃連堿、藥根堿、人參皂苷、芒果苷、知母皂苷、姜辣素等，得到220 個(gè)基因靶點(diǎn)，構(gòu)建了藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果表明一個(gè)藥物的一個(gè)成分可同時(shí)作用于多個(gè)基因靶點(diǎn)，同時(shí)多個(gè)藥物的多個(gè)成分也可以作用于同一個(gè)基因靶點(diǎn)，故提示干姜黃芩黃連人參湯是通過(guò)多成分多靶點(diǎn)多途徑起到干預(yù)治療作用。

本實(shí)驗(yàn)下一步獲取了T2DM 的基因靶點(diǎn)，按照獲取基因靶點(diǎn)目標(biāo)篩選，最終得到2062 個(gè)基因靶點(diǎn)。然后與干姜黃芩黃連人參湯藥物活性成分靶點(diǎn)取交集，共得到共同靶點(diǎn)148 個(gè)，最后通過(guò)對(duì)交集基因進(jìn)行PPI 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，而且通過(guò)CytoScape3.7.1 軟件分析得到核心作用基因靶點(diǎn)：TNF、IL-6、TP53、CASP3、IL-10、MAPK1、AKT1、VEGFA、MMP9、EGFR1、MYC、PTGS2、MAPK8、EGF、IL-1β等，在核心基因靶點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)以IL-6、IL-10、IL-1β、TNF等調(diào)節(jié)免疫炎癥基因靶點(diǎn)在PPI 網(wǎng)絡(luò)互作圖中相互作用明顯，這也就提示干姜黃芩黃連人參湯可能是通過(guò)免疫炎癥途徑干預(yù)T2DM 的作用機(jī)制。

通過(guò)GO 生物功能與KEGG 通路富集分析，發(fā)現(xiàn)干姜黃芩黃連人參湯可通過(guò)AGE-RAGE 信號(hào)通路、NF-κB 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、JAK-STAT 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、HIF-1 信號(hào)通路等多種信號(hào)通路干預(yù)T2DM，初步揭示了該方具有調(diào)控多種信號(hào)通路改善T2DM 胰島素抵抗的作用。

總之，本實(shí)驗(yàn)研究初步表明，干姜黃芩黃連人參湯具有改善T2DM 的作用，體現(xiàn)了該方多成分、多靶點(diǎn)及多途徑的作用特點(diǎn)，且可能通過(guò)免疫炎癥途徑改善T2DM 的重要作用途徑，下一步擬通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法、流式細(xì)胞術(shù)與蛋白組學(xué)技術(shù)Western blot 法等檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步明確干姜黃芩黃連人參湯干預(yù)T2DM 的生物學(xué)機(jī)制。