S100A1在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖的影響*

田 甜,宋秀紅,孔 琰,王靈芝,劉翔宇,楊 晶,崔竹梅

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院婦科，青島 266061)

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見惡性腫瘤。多種因素可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展，但是具體機制尚不明確。S100蛋白作為EF手相鈣結(jié)合蛋白家族中的最大成員，具有調(diào)控細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)錄因子等多種生物學(xué)功能[1]，與腫瘤關(guān)系密切[2]。S100A1與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，但是其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達和作用尚不明確。本研究通過免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1表達水平，通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達S100A1的子宮內(nèi)膜癌細胞系，通過細胞外功能實驗明確S100A1對子宮內(nèi)膜癌細胞增殖、細胞周期調(diào)控、遷移和侵襲的影響，探討S100A1在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 資料來源

1.1.1 組織標本 收集2003年1月至2005年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的74例子宮內(nèi)膜癌、14例子宮內(nèi)膜不典型增生和26例良性子宮內(nèi)膜增生患者的臨床資料和石蠟標本。子宮內(nèi)膜癌患者的年齡為(53.48±9.14)歲；臨床分期：Ⅰ期59例，Ⅱ～Ⅳ期15例；病理分化程度：高分化者24例，中分化者33例，低分化者10例，7例非子宮內(nèi)膜樣腺癌被排除。子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前均未接受放化療。子宮內(nèi)膜良性增生包括單純性增生和復(fù)雜性增生。手術(shù)分期依據(jù)2009年FIGO分期標準。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會的討論并獲得同意。

1.1.2 細胞與試劑 人腎上皮細胞系293細胞、子宮內(nèi)膜癌細胞系HEC-1A和HEC-1B細胞均源自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，由課題組實驗室保存。PV-9000免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋。慢病毒質(zhì)粒pLVX-IRES-Neo和慢病毒包裝質(zhì)粒pCMVΔ8.9、VSVG和PLP2為課題實驗組保存。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國GIBCO公司；逆轉(zhuǎn)錄檢測試劑盒購自美國ABI公司；實時定量PCR試劑盒購自日本Takara公司；蛋白印跡(Western blot)法檢測試劑購自美國Pierce公司；活細胞計數(shù)(CCK-8)法檢測試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所。單克隆鼠抗S100A1、β-actin抗體購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法 組織切片脫蠟，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗。3%過氧化氫室溫孵育，檸檬酸鹽緩沖液的修復(fù)盒中進行高壓抗原修復(fù)。冷卻，血清封閉。一抗過夜孵育，辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗工作液室溫孵育30min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色和蘇木素復(fù)染，脫水并封片。陰性對照用PBS緩沖液替換一抗。數(shù)字圖像掃描儀Scanscope XT獲取圖像，使用Aperio Image Scope軟件(美國Aperio公司)進行染色定量評分。軟件自動計數(shù)每個視野中弱陽性細胞數(shù)(Nwp)、陽性細胞數(shù)(Np)、強陽性細胞數(shù)(Nsp)及總細胞數(shù)(Ntotal)。每份標本采用半定量方法，按不同染色強度細胞所占百分比分別賦值之和進行計算，計算公式為(Nwp/Ntotal)×(100)+(Np/Ntotal)×(200)+(Nsp/Ntotal)×(300)[3]。

1.2.2 過表達S100A1子宮內(nèi)膜癌細胞的構(gòu)建及鑒定 (1)細胞系構(gòu)建和篩選：將擴增的S100A1 cDNA克隆到pLVX-IRES-Neo的XhoI/BamHI酶切位點，構(gòu)建慢病毒載體。按Lipofectamine 2000說明書步驟進行轉(zhuǎn)染。5μg pLVX-IRES-Neo-S100A1或pLVX-IRES-Neo、1.25μg VSVG、3.75μg pCMVΔ8.91和1.25μg PLP2轉(zhuǎn)染293T細胞。收集病毒上清，-80℃保存。病毒感染子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1A和HEC-1B。400μg/mL G418進行穩(wěn)定細胞的篩選。(2)鑒定：①Western blot法檢測HEC-1A和HEC-1B細胞中S100A1表達：裂解細胞,BCA法測定蛋白濃度。取定量蛋白進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜、一抗4℃孵育過夜、二抗孵育1h，增強化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯色，凝膠成像儀采集成像。應(yīng)用Image J軟件進行分析。②熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測S100A1 mRNA表達:TRIzol試劑(Invitrogen)提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)和StepOne Plus實時熒光定量PCR儀進行檢測。PCR反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30s；90℃ 5s，55℃ 35s，共40個循環(huán)。按公式2-△△Ct分析S100A1 mRNA表達水平。S100A1基因引物序列，上游：5'-CCGCTCGAGAGCAGCCACATTTGCAACCT-3'，下游：5'-CGCGGATCCGCTGGTGAGAGAGAAGCCTTTA-3'。

1.2.3 CCK-8法檢測子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖能力 將子宮內(nèi)膜癌細胞按3×103細胞/孔接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔。于24、48、72h去除培養(yǎng)液，加稀釋的CCK-8 10μL，37℃溫箱作用1h，酶標儀檢測450nm吸光度(A)值。根據(jù)A值繪制細胞增殖曲線。

1.2.4 流式細胞儀檢測子宮內(nèi)膜癌細胞周期比例 0.25%胰蛋白酶收集細胞，制成單細胞懸液。PBS洗滌，冰冷70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗滌細胞2次，500μL碘化丙啶(PI)染色液37℃避光放置30min。使用FACSCalibur流式細胞儀檢測染色細胞。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室和劃痕實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 Transwell小室實驗：提前制備平鋪matrigel的小室。無血清培養(yǎng)基制備單細胞懸液，200μL細胞懸液加入平鋪和未平鋪matrigel的Transwell上室，600μL含10%胎牛血清細胞液加入下室，溫箱培養(yǎng)24h。去除上室表面細胞，4%多聚甲醛固定，0.3%結(jié)晶紫染色。顯微鏡拍照，統(tǒng)計穿膜細胞數(shù)。實驗重復(fù)3次。劃痕實驗：將相同數(shù)量的子宮內(nèi)膜癌細胞接種于6孔板，用相同型號的移液管刮取細胞層。PBS清洗去除細胞碎片，于0h和24～48h拍攝圖像，測量劃痕距離。

2 結(jié) 果

2.1 子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1蛋白表達水平比較 免疫組化結(jié)果表明，S100A1主要表達于細胞漿和細胞核(圖1)。子宮內(nèi)膜癌組織、子宮內(nèi)膜不典型增生組織中S100A1蛋白表達水平顯著高于良性增生子宮內(nèi)膜組織(Z=-3.53，P=0.000；Z=-3.001，P=0.003)；子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜不典型增生組織之間無明顯差異(Z=-0.201，P=0.84)(圖2)。子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1表達水平與年齡有相關(guān)性(Z=-3.822，P=0.000)，與肌層浸潤、宮頸受累、組織學(xué)類型、FIGO分期、腫瘤分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P均>0.05)。見表1。

圖1 免疫組化法檢測S100A1蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(SP法×400)

圖2 免疫組化分值

表1 S100A1在子宮內(nèi)膜癌中的表達和臨床病理參數(shù)分析

2.2 穩(wěn)定表達S100A1基因的HEC-1A和HEC-1B細胞系的建立及鑒定 本研究成功構(gòu)建轉(zhuǎn)染S100A1基因的子宮內(nèi)膜癌細胞系。Western blot法檢測顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細胞中S100A1蛋白表達強度均明顯高于各自對照組。qRT-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A細胞、HEC-1B細胞的S100A1 mRNA表達水平分別為(831.67±47.56)和(390.50±47.56)，均明顯高于對照組細胞(t=17.47，P=0.0001；t=8.19，P=0.001)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染組和對照組子宮內(nèi)膜癌細胞中S100A1蛋白表達

2.3 轉(zhuǎn)染組和對照組子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力的比較 CCK-8法檢測顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A細胞培養(yǎng)48h的A值(0.69±0.02)明顯高于對照組(0.62±0.02，t=4.778，P=0.008)，培養(yǎng)72h的A值(1.09±0.05)明顯高于對照組(0.90±0.09，t=3.327，P=0.029)；轉(zhuǎn)染組HEC-1B細胞培養(yǎng)48h的A值(1.08±0.04)明顯高于對照組(0.87±0.03，t=7.166，P=0.002)，培養(yǎng)72h的A值(2.29±0.05)明顯高于對照組(1.98±0.10，t=4.925，P=0.0079)。見圖4。

圖4 CCK-8檢測子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力的變化

2.4 轉(zhuǎn)染組和對照組子宮內(nèi)膜癌細胞的細胞周期比較 轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細胞的G2/M期細胞比例分別為(13.19±0.02)%和(19.94±0.36)%，明顯高于對照組[(11.68±0.47)%和(16.66±0.85)%]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。HEC-1A細胞轉(zhuǎn)染組與對照組相比，G1期細胞比例顯著下降[(64.60±0.16)% vs(67.90±0.28)%，P<0.05]，S期細胞比例無明顯變化[(22.27±0.06)% vs(20.45±0.76)%，P<0.05]。HEC-1B細胞轉(zhuǎn)染組與對照組相比，G1期細胞比例顯著增高[(45.41±0.35)vs(42.35±0.65)%，P<0.05]，S期細胞比例顯著下降[(34.66±0.01)%與(40.99±0.20)%，P<0.05]。見圖5。

圖5 流式細胞儀檢測子宮內(nèi)膜癌細胞周期比例的變化

2.5 轉(zhuǎn)染組和對照組子宮內(nèi)膜癌細胞遷移和侵襲能力的比較 Transwell體外遷移實驗顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細胞的穿膜細胞數(shù)分別為(106±15)和(38±12)個，對照組的穿膜細胞數(shù)分別為(120±9)和(41±3)個，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Transwell體外侵襲實驗顯示，轉(zhuǎn)染組HEC-1A和HEC-1B細胞的穿膜細胞數(shù)分別為(120±15)和(96±12)個，對照組的穿膜細胞數(shù)分別為(109±4)和(108±21)個，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。劃痕實驗結(jié)果顯示，兩組子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移能力無明顯變化。

3 討 論

S100蛋白屬于EF手相鈣結(jié)合蛋白家族成員，在體內(nèi)發(fā)揮廣泛的生物學(xué)作用，如鈣離子穩(wěn)態(tài)、細胞骨架構(gòu)成、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、細胞增殖分化、細胞周期、細胞運動、炎性反應(yīng)等[4]。多種S100蛋白如S100P、S100A4、S100A7、S100A8/A9、S100A14參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5-9]。S100A1主要在心肌中表達，調(diào)節(jié)心肌內(nèi)Ca2+環(huán)境、細胞收縮和能量代謝[10]。S100A1在病理條件下表達異常，與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)[11]。研究發(fā)現(xiàn)，S100A1在黑色素瘤、腎細胞癌、乳腺癌、卵巢癌和甲狀腺癌的發(fā)生進展過程中發(fā)揮重要作用[12-16]。然而，S100A1在子宮內(nèi)膜癌中的表達和作用尚不清楚。本研究通過免疫組化法檢測S100A1在子宮內(nèi)膜組織中的表達，結(jié)果顯示其在子宮內(nèi)膜癌和子宮內(nèi)膜不典型增生組織中的表達均高于良性子宮內(nèi)膜組織，表明S100A1在子宮內(nèi)膜癌和癌前病變組織中表達異常，可能在良性子宮內(nèi)膜向惡性腫瘤發(fā)生癌變的病理過程中發(fā)揮一定的促進作用。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌組織中S100A1表達水平與年齡相關(guān)，與肌層浸潤、宮頸受累、組織學(xué)類型、FIGO分期、腫瘤分級、腫瘤大小和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征無明顯相關(guān)性；良性子宮內(nèi)膜及不典型增生子宮內(nèi)膜的S100A1蛋白表達與年齡無相關(guān)性。DeRycke等[17]報道，在子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌中，S100A1表達量與腫瘤分化和臨床分期無相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致。本研究未行生存預(yù)后分析。研究發(fā)現(xiàn),子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌中S100A1高表達與患者無復(fù)發(fā)生存率下降有關(guān)，認為S100A1可作為子宮內(nèi)膜樣惡性腫瘤預(yù)后不良的標志[17]。

本研究結(jié)果表明，S100A1增強子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖能力，但不影響細胞遷移和侵襲能力。有研究發(fā)現(xiàn)，S100A1在神經(jīng)細胞中調(diào)節(jié)細胞增殖[18-19]，參與腫瘤細胞增殖的異常調(diào)節(jié)[1]。細胞周期改變引起的細胞增殖失調(diào)是腫瘤發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，S100A1蛋白參與腫瘤細胞周期的調(diào)控[13]。本研究結(jié)果顯示，S100A1過表達的子宮內(nèi)膜癌細胞G2/M期細胞比例顯著增加。S100A1促進腫瘤細胞增殖可能與調(diào)節(jié)細胞周期有關(guān)，但是具體作用機制尚不明確。多數(shù)S100蛋白家族通過與RAGE相互作用并激活細胞信號通路發(fā)揮作用，該信號通路涉及MAP激酶、NF-κB和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt信號通路[1]。子宮內(nèi)膜癌中S100A1蛋白調(diào)控細胞周期的分子機制需進一步深入研究。

綜上所述，S100A1在子宮內(nèi)膜癌中表達異常，促進子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖，影響細胞周期調(diào)控。因此,S100A1在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為子宮內(nèi)膜癌的治療提供新的分子靶點。