原纖維蛋白1基因在胃癌組織中的表達、功能富集及信號通路生物信息學分析

姚坤厚，李 昊，王晨宇，張軍杰，李興旺

(河南大學淮河醫(yī)院普通外科，河南 開封 475000)

胃癌是臨床上較為常見的一類消化系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。胃癌發(fā)生的危險因素包括幽門螺桿菌感染、吸煙、飲食因素、肥胖和遺傳等。約10%的胃癌患者有胃癌家族史。全球范圍內胃癌的發(fā)病率在癌癥中居第5位，病死位居第3位[2]。目前，胃癌發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉移的分子機制仍未完全闡明。隨著分子生物學技術、高通量測序技術、基因組技術以及轉錄組技術的不斷進步，越來越多的證據表明，某些驅動基因時空表達的失調是胃癌發(fā)生的重要原因。原纖維蛋白1(fibrillin 1，F(xiàn)BN1)是原纖維蛋白家族的成員之一,是一種細胞外基質糖蛋白，是鈣結合微纖維的結構成分[3-4]。微纖維在全身彈性和非彈性結締組織中提供承重結構支撐。已有研究報道，F(xiàn)BN1的異常表達與多種實體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關[5-6]，但其與胃癌的關系鮮有報道?；诖?，本研究采用生物信息學分析方法探討了FBN1基因在胃癌組織中的表達、功能富集及信號通路。

1 資料與方法

1.1 一般資料在癌癥基因組圖譜數據庫(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中檢索FBN1 mRNA表達水平，比較胃癌組織及癌旁正常組織中FBN1基因相對表達情況。TCGA數據庫中檢索詞為“胃癌”和“FBN1 mRNA”，檢索物種為人類。

1.2 FBN1基因相關蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網絡構建應用STRING數據庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)[7]對FBN1 mRNA及相關基因編碼蛋白進行PPI網絡構建，物種選擇人，作用蛋白不少于21個，相互作用關系置信度大于0.4。

1.3 基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析應用David數據庫對FBN1基因進行GO功能富集和KEGG分析。GO功能富集包括細胞組分富集、分子功能富集和生物學過程富集。

1.4 FBN1 mRNA表達水平與淋巴細胞浸潤關系分析應用腫瘤免疫評估資源數據庫(tumor immune estimation resource,TIMER)(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)分析FBN1 mRNA表達水平與胃癌患者淋巴細胞浸潤關系。檢索詞為“stomach cancer”和“FBN1 mRNA”。

1.5 生存分析根據胃癌組織中FBN1 mRNA表達水平的中位數，將胃癌患者分為高表達組(n=126)和低表達組(n=118)。胃癌組織中FBN1 mRNA表達水平大于等于中位數為高表達組，反之為低表達組。記錄2組胃癌患者總生存期(overall survival，OS)和無疾病進展生存期(disease free survival，DFS)。

1.6 統(tǒng)計學處理本研究所涉及數據分析應用R軟件完成(https://www.r-project.org/)。FBN1基因的功能富集采用Chisquare檢驗；采用Pearsn相關進行相關性分析，采用Cox回歸模型的log-rank進行生存分析，并計算風險比(hazard ratio，HR);P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FBN1 mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達比較結果見圖1。FBN1 mRNA在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 FBN1 mRNA在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達

2.2 PPI網絡分析結果見圖2。FBN1基因PPI中共有21個蛋白和143個相互作用關系。21個蛋白分別為重組人黏結蛋白聚糖2(syndecan 2，SDC2)、γ-纖維蛋白原多肽 (fibrinogen gamma chain, FGG)、層黏連蛋白β1 (laminin-beta-1,LAMB1)、整合素β1 (integrin subunit beta 1, ITGB1)、整合素α5(subunit alpha 5, ITGA5)、 Ⅲ型膠原蛋白α1(type Ⅲ collagen alpha-1, COL3A1)、微纖絲相關蛋白2(microfibril associated protein 2,MFAP2)、微纖絲相關蛋白5(microfibril associated protein 5,MFAP5)、FBN1, 弗林蛋白酶(Furin)、釉蛋白(enamelin, ENAM)、 整合素和金屬蛋白酶10 (a disintegrin and metalloproteinase 10, ADAM10)、淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、基質金屬蛋白酶組織抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinases 1,TIMP1)、層粘連蛋白γ1(laminin-γ-1, LAMC1)、纖維連接蛋白1(fibronectin 1，F(xiàn)N1)、FBN1、潛在轉化生長因子β結合蛋白-1(latent transforming growth factor-beta binding protein 1,LTBP1)、卵泡抑制素樣蛋白l(follistatin-like protein 1,FSTL1)、多能蛋白聚糖(versican,VCAN) 。各蛋白平均相互作用指數為 0.816，網絡中各個蛋白功能富集明顯(P<0.05)。

圖2 FBN1基因編碼蛋白PPI網絡

2.3 FBN1基因功能富集分析結果見表1、表2和表3。FBN1基因功能富集分析顯示，F(xiàn)BN1基因生物學過程主要富集于翻譯后蛋白質修飾、解剖結構發(fā)育和細胞基質黏附等；細胞組分主要富集于內質網內腔、細胞外基質和內質網等；分子功能主要富集于細胞黏附分子結合、整合素結合和結構分子活性等。

表2 FBN1基因細胞組分富集分析

表3 FBN1基因分子功能組分富集分析

2.4 FBN1基因生物學功能富集KEGG分析結果見表4。FBN1基因KEGG信號通路主要富集于細胞外基質(extracellular matrix，ECM)受體相互作用、黏著、胃腸道腫瘤等。

表4 KEGG所富集的FBN1基因生物學功能

2.5 FBN1 mRNA表達與淋巴細胞浸潤FBN1 mRNA表達與CD8+T細胞、CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞浸潤呈正相關(r=0.248、0.412、0.665、0.353、0.412，P<0.05)。

2.6 生存分析FBN1高表達組胃癌患者OS顯著短于低表達組(HR=1.86,95%置信區(qū)間1.50～2.31,P<0.05);高表達組胃癌患者DFS顯著短于低表達組(HR=1.93，95%置信區(qū)間1.50～2.45，P<0.05)。

3 討論

FBN1蛋白由位于15號染色體上的FBN1基因編碼，F(xiàn)BN1有65個編碼外顯子，編碼一個含 2 871個氨基酸的前蛋白profibrillin，profibrillin被furin轉化酶進行蛋白質水解切割，產生FBN1蛋白和蛋白質激素asprosin[8-9]。FBN1蛋白是一種大分子的細胞外基質糖蛋白，是10～12 nm鈣結合微纖維的結構成分[10-11]。近年來陸續(xù)有文獻報道，F(xiàn)BN1 mRNA表達水平與多種實體腫瘤的預后有關[12-13]。郭棟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)BN1 蛋白在胃癌組織中的表達與胃癌的浸潤深度、淋巴結轉移、TNM 分期密切相關,并可作為胃癌患者術后生存時間的評估指標。WANG等[15]研究發(fā)現(xiàn)，Aurora-A可誘導FBN1的表達，但在被BRCA2抑制的情況下可促進卵巢癌轉移。

本研究采用生物信息大數據挖掘技術探討了FBN1基因在胃癌中的表達、相關生物學功能和信號通路及其與患者生存期的關系，結果顯示，F(xiàn)BN1 mRNA在胃癌患者癌組織中的表達水平顯著上調。提示FBN1可能參與了人胃癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究生存分析顯示，F(xiàn)BN1 mRNA高表達組患者OS和DFS均顯著低于低表達組，提示FBN1 mRNA的高表達與胃癌患者生存期短有關，并有望成為胃癌相關藥物研發(fā)的潛在靶點。

綜上所述，F(xiàn)BN1基因在胃癌患者癌組織中表達水平顯著升高，且高表達患者OS和DFS顯著降低。因此，推測FBN1與患者的預后不良有關，抑制胃癌患者FBN1的表達，有望改善患者生存期。但本研究主要從生物信息方面進行了數據挖掘和分析，缺乏細胞實驗和臨床試驗驗證，后續(xù)應進行相關的細胞、動物實驗對本次研究結果進行進一步的證實。