水通道蛋白-9在缺氧缺血性腦病新生小鼠認(rèn)知功能障礙中的作用

巴慶華

(河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 鄭州 450000)

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是指圍生期各種原因?qū)е碌男律鷥喝毖跞毖阅X部病變[1]。HIE是新生兒死亡和繼發(fā)性腦性癱瘓及智力障礙等的重要原因，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜[2]。隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HIE患兒病死率逐年下降，但存活新生兒常遺留認(rèn)知功能障礙，嚴(yán)重影響患兒的生存質(zhì)量[3-4]。水通道蛋白-9(aquaporin-9，AQP-9)廣泛存在于腦組織，在皮層和海馬組織中均有表達(dá)[5-6]。有研究顯示，AQP-9對(duì)甘油、乳酸、尿素的強(qiáng)通透性不僅參與水的運(yùn)輸和平衡，而且參與腦組織能量代謝[7]。田培超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HIE小鼠腦組織中AQP-9表達(dá)水平顯著升高，提示AQP-9可能在HIE的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)，小鼠海馬組織損傷后AQP-9表達(dá)水平升高[9]，而海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)空間記憶和學(xué)習(xí)至關(guān)重要的區(qū)域[10]，因此，APQ-9可能與認(rèn)知功能損害有關(guān)。陸蔚天等[11]建立了阿爾茨海默病小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降，并且海馬和齒狀回組織中APQ-9表達(dá)明顯上調(diào)，推測(cè)APQ-9與阿爾茨海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶損傷有關(guān)。本研究通過(guò)建立HIE小鼠模型，觀察HIE小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化和海馬組織中APQ-9及增殖細(xì)胞核抗原Ki-67的表達(dá)，探討APQ-9在HIE小鼠認(rèn)知功能損傷中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物90只健康無(wú)特定病原級(jí)雄性昆明新生小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK(京)2021-0006，7日齡，體質(zhì)量(6.25±1.02)g。

1.2 主要試劑和儀器抗AQP-9和Ki-67多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，免疫熒光試劑盒購(gòu)自上海臥宏生物科技有限公司，重組鼠AQP-9購(gòu)自上海鈺博生物科技有限公司，AQP-9和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)引物購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，生物素標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)相關(guān)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。PCR擴(kuò)增儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司，WD-9413C型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自北京六一生物科技有限公司，Champ ChemiTMTop 610全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光熒光分析儀購(gòu)自西安中團(tuán)生物科技有限公司，CR22GⅢ高速離心機(jī)購(gòu)自日本日立公司，Etho -Vision XT 7.0行為影像采集系統(tǒng)購(gòu)自荷蘭Noldus公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組和HIE模型制備將90只昆明小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和AQP-9組，每組30只。對(duì)照組小鼠正常喂養(yǎng)，不建立HIE模型。模型組和AQP-9組小鼠參照NEMETH等[12]報(bào)道的方法構(gòu)建HIE小鼠模型，模型制備方法：異氟烷吸入麻醉下行頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，采用電凝法閉合頸總動(dòng)脈，隨后縫合傷口；術(shù)后將動(dòng)物放置于37 ℃密閉艙內(nèi)，通入含體積分?jǐn)?shù)5% CO2的氮?dú)?，將氧體積分?jǐn)?shù)調(diào)至8%，1.5 h后取出，送回母鼠籠中繼續(xù)喂養(yǎng)。建模成功后30 min，AQP-9組小鼠給予腹腔單次注射20 μg AQP-9進(jìn)行干預(yù)，對(duì)照組和模型組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水。

1.3.2 腦組織取材分別于干預(yù)后第1、3、7天，每組選取10只小鼠頸椎脫臼處死，剪下小鼠頭部后立即在冰上解剖，分離并取出海馬組織，標(biāo)記后于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每次隨機(jī)選取5只小鼠的海馬組織制備石蠟切片，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)；另5只小鼠的海馬組織分為2份，一份用于提取RNA，另一份用于Western blotting檢測(cè)。

1.3.3 反轉(zhuǎn)錄PCR法檢測(cè)小鼠海馬組織中AQP-9 mRNA表達(dá)取對(duì)照組和模型組小鼠海馬組織，采用TRIzol法提取總RNA，以提取出的總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，然后進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共計(jì)40個(gè)循環(huán)，以GAPDH為內(nèi)參。AQP-9上游引物序列為5′-GCAGTAGCCATGTACAG-3′，下游引物序列為5′-TGACCATGACCATGAC-3′；GAPDH上游引物序列為5′-ACCATAGCCATGGACATAG-3′，下游引物序列為5′-GTTACCATAGCCATGACA-3′。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描條帶的灰度值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算AQP-9 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3.4 免疫熒光法檢測(cè)小鼠海馬組織中AQP-9和Ki-67蛋白表達(dá)取小鼠海馬組織，40 g·L-1多聚甲醛固定、水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯中浸泡、石蠟包埋，制作5 μm厚的石蠟切片；將切片進(jìn)行二甲苯浸泡脫蠟、抗原修復(fù)、體積分?jǐn)?shù)5%山羊血清封閉；加AQP-9(對(duì)照組和模型組)和Ki-67(對(duì)照組、模型組和AQP-9組)兔抗小鼠一抗(滴度11 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，每次 5 min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(滴度1500)，室溫孵育1 h；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色15 min，用Tris緩沖鹽溶液洗滌5 min；封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。AQP-9、Ki-67蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)著紅色，細(xì)胞核著藍(lán)色，Merged指2種染色同時(shí)出現(xiàn)。應(yīng)用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析圖像的吸光度值，以吸光度值表示AQP-9和Ki-67蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力干預(yù)后第3～7天處死小鼠前進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。將3組小鼠分別從4個(gè)象限放入水中，記錄小鼠爬上平臺(tái)所用時(shí)間(平臺(tái)置于第3象限，低于水位2 cm)，應(yīng)用EthoVision XT 7.0行為影像采集系統(tǒng)記錄小鼠60 s內(nèi)爬上平臺(tái)所需時(shí)間(逃避潛伏期)。逃避潛伏期越短，提示小鼠學(xué)習(xí)記憶力越好[13]。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組和模型組小鼠海馬組織中AQP-9 mRNA表達(dá)比較結(jié)果見(jiàn)表1。干預(yù)后第1、3、7天對(duì)照組小鼠海馬組織中AQP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組小鼠干預(yù)后第3天時(shí)海馬組織中AQP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于干預(yù)后第1、7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠干預(yù)后第1天與第7天時(shí)海馬組織中AQP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后第1、3、7天，模型組小鼠海馬組織中AQP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 對(duì)照組和模型組小鼠海馬組織中AQP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 對(duì)照組和模型組小鼠海馬組織中AQP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖1和表2。干預(yù)后第1、3、7天對(duì)照組小鼠海馬組織中AQP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組小鼠干預(yù)后第3天時(shí)海馬組織中AQP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于干預(yù)后第1、7天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠干預(yù)后第1天與第7天時(shí)海馬組織中AQP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。干預(yù)后第1、3、7天，模型組小鼠海馬組織中AQP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 干預(yù)后第3天對(duì)照組和模型組小鼠海馬組織中AQP-9蛋白表達(dá)(免疫熒光染色，×200)

表2 對(duì)照組和模型組小鼠海馬組織中AQP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 對(duì)照組、模型組和AQP-9組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表3。對(duì)照組小鼠干預(yù)后第1、3、7天海馬組織中Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組和AQP-9組小鼠干預(yù)后第7天時(shí)海馬組織中Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于干預(yù)后第1、3天，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；干預(yù)后第1、3、7天，模型組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，AQP-9組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組和模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 干預(yù)后第7天對(duì)照組、模型組和AQP-9組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白表達(dá)(免疫熒光染色，×200)

表3 對(duì)照組、模型組和AQP-9組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 對(duì)照組、模型組和AQP-9組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較結(jié)果見(jiàn)表4。干預(yù)后第3～7天，對(duì)照組和AQP-9組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期均逐漸縮短(P<0.05)，而模型組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期無(wú)顯著變化(P>0.05)。干預(yù)后第3、4、5天，3組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后第6、7天時(shí)，模型組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干預(yù)后第6天，AQP-9組與對(duì)照組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干預(yù)后第7天，AQP-9組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期顯著短于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 對(duì)照組、模型組和AQP-9組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較

3 討論

HIE是新生兒死亡和發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的主要原因，近年來(lái)，隨著醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，HIE患兒存活率顯著提高，但HIE患兒往往存在不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給患兒及其家庭、社會(huì)造成沉重的負(fù)擔(dān)[14]。HIE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素的病理生理過(guò)程。因此，闡明導(dǎo)致新生兒HIE的發(fā)病機(jī)制對(duì)降低HIE的傷殘率具有重要意義。

學(xué)習(xí)和記憶是人類賴以生存、不可缺少的高級(jí)神經(jīng)生理活動(dòng)，缺血缺氧會(huì)導(dǎo)致局部腦組織損傷，損害大腦的學(xué)習(xí)記憶功能，海馬主要負(fù)責(zé)長(zhǎng)時(shí)記憶的存儲(chǔ)轉(zhuǎn)換和定向等功能，與學(xué)習(xí)和記憶功能密切相關(guān)[15]。AQP-9廣泛存在于細(xì)胞膜上，是具有促進(jìn)水分子快速跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用的水通道蛋白[16]。AQP-9在神經(jīng)系統(tǒng)中的主要作用是參與水平衡和能量代謝，對(duì)腦內(nèi)水轉(zhuǎn)運(yùn)和腦脊液循環(huán)有重要作用[17]。田培超等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HIE小鼠建模后30、60、90、120 min，頂葉組織中AQP-9 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常小鼠，提示AQP-9可能在HIE的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后第1、3、7天，模型組小鼠海馬組織中AQP-9 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，模型組小鼠干預(yù)后第3天時(shí)海馬組織中AQP-9 mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于干預(yù)后第1、7天，提示AQP-9在HIE小鼠海馬組織中表達(dá)上調(diào)，且AQP-9的表達(dá)可能有時(shí)間窗，AQP-9可能與小鼠HIE的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。小鼠腦部缺血缺氧可導(dǎo)致細(xì)胞膜上Na+-K+-ATP酶功能障礙，上調(diào)蛋白激酶A的表達(dá)，激活A(yù)QP-9 mRNA表達(dá)，從而使AQP-9蛋白表達(dá)升高。本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察3組小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，結(jié)果顯示，隨著測(cè)試時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)照組和AQP-9組小鼠逃避潛伏期均明顯縮短，而模型組小鼠逃避潛伏期未見(jiàn)明顯變化；干預(yù)后第6、7天，模型組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期顯著長(zhǎng)于對(duì)照組，提示HIE小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力受損。干預(yù)后第7天，AQP-9組小鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期顯著短于模型組，提示外源性AQP-9可以顯著改善HIE小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。HWANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，沙鼠腦缺血缺氧 5 min 后海馬CA1區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞中AQP-9 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)。JI等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧后小鼠海馬神經(jīng)元明顯丟失，血管生成明顯減少，且海馬中AQP-9蛋白表達(dá)水平明顯上升。

Ki-67是細(xì)胞增殖的內(nèi)源性標(biāo)志物。王驊等[19]研究發(fā)現(xiàn)，HIE新生小鼠腦組織中Ki-67表達(dá)水平明顯下降，提示缺血缺氧損傷會(huì)降低神經(jīng)細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)后第1、3、7天，模型組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組，AQP-9組小鼠海馬組織中Ki-67蛋白表達(dá)顯著高于對(duì)照組和模型組，提示外源性AQP-9蛋白可能通過(guò)上調(diào)Ki-67蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖，從而改善HIE小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。

綜上所述，AQP-9在HIE小鼠海馬組織中表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)有時(shí)間窗；外源性AQP-9可能通過(guò)促進(jìn)Ki-67蛋白的表達(dá)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖，從而改善小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。本研究尚存在不足之處，雖然發(fā)現(xiàn)外源性AQP-9可能通過(guò)促進(jìn)Ki-67蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞增殖，但未明確其具體的機(jī)制；另外，本研究檢測(cè)了海馬組織中AQP-9的表達(dá)，未檢測(cè)大腦皮層及基底節(jié)區(qū)AQP-9的表達(dá)，而這些腦區(qū)與認(rèn)知功能密切相關(guān)；這些方面有待于后期實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。