早期重度中暑巴馬小型豬腎組織病理學(xué)特點及相關(guān)炎癥因子表達(dá)

何嘉騏，張 靜，倪 軍

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.中國人民解放軍陸軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院腎臟內(nèi)分泌科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

重度中暑是指在高溫環(huán)境中長時間暴露或劇烈運動后導(dǎo)致機體核心溫度高于40 ℃，并出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常，如神志不清、抽搐或昏迷的急性疾病。重度中暑患者常出現(xiàn)廣泛的組織損傷、橫紋肌溶解、彌散性血管內(nèi)凝血和多器官功能障礙[1-3]。重度中暑是危及生命的一種疾病，隨著全球氣溫的升高，其病死率逐年增加[4-5]。有研究表明，重度中暑是一種與全身炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的高熱狀態(tài)，會導(dǎo)致包括急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)在內(nèi)的多器官功能障礙[6]。白細(xì)胞和腎小管細(xì)胞在AKI患者受損的腎臟中會釋放白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等一系列促炎細(xì)胞因子，從而加重腎功能損傷[7-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，將雄性巴馬小型豬進(jìn)行約4 h的嚴(yán)重?zé)岜┞逗?巴馬小型豬出現(xiàn)自主行為異常、核心體溫升高、生理反射遲鈍或消失等重度中暑早期癥狀[11]。目前，關(guān)于重度中暑的相關(guān)研究主要是以小鼠為模型，以大型動物為模型的相關(guān)研究較少?；诖耍狙芯恐荚谔接懺缙谥囟戎惺畎婉R小型豬腎組織病理學(xué)變化及相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，以期為重度中暑患者的早期預(yù)防和臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性巴馬小型豬12只，體質(zhì)量10～15 kg，購自泰州泰和生物科技有限公司動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2017-0010，飼養(yǎng)于中國人民解放軍陸軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院動物實驗室，溫度(24.92±0.41)℃，12 h交替自然光照射，間斷通風(fēng)，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑與儀器兔抗IL-1α多克隆抗體、兔抗TNF-α多克隆抗體購自北京Affinity Biosciences公司，山羊抗兔免疫球蛋白G購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鹽酸艾司氯胺酮注射液購自江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)試劑盒購自上海生物工程科技有限公司。改良型F800-Z恒溫恒濕氣候艙購自廣東富宸電器有限公司，全自動生物化學(xué)分析儀購自美國貝克曼庫爾特公司，全自動尿液分析儀購自愛威科技股份有限公司，高靈敏度電子體溫計購自湖南省瑞博科技有限公司，高精度專業(yè)電子計數(shù)秤購自永州衡器有限公司，光學(xué)顯微鏡購自廈門麥克奧迪有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗分組及早期重度中暑模型構(gòu)建將12只巴馬小型豬按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，每組6只。2組巴馬小型豬適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食、禁水12 h，將模型組巴馬小型豬于溫度42～45 ℃，濕度70%～80%透明恒溫恒濕箱中進(jìn)行熱暴露；每間隔30 min記錄1次模型組巴馬小型豬的核心體溫、結(jié)膜顏色、角膜反射、提睪反射、精神狀態(tài)，當(dāng)核心體溫達(dá) 42 ℃，結(jié)膜充血，提睪反射、角膜反射明顯減弱或消失即為造模成功[11]。對照組巴馬小型豬不做任何處理。本研究經(jīng)中國人民解放軍第八十三集團(tuán)軍醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.3.2 2組巴馬小型豬血清肌酐、尿素氮及尿蛋白水平檢測造模成功后，立即在室溫下用20 mg·kg-1鹽酸艾司氯胺酮注射液(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字H20193336)耳后注射麻醉2組巴馬小型豬，麻醉后將2組巴馬小型豬固定于動物解剖實驗臺上，采集腹腔靜脈血及膀胱內(nèi)尿液送檢，然后處死。取2組巴馬小型豬腹腔靜脈血10 mL，3 500 r·min-1離心3 min，分離血清，使用全自動生物化學(xué)分析儀測定血清肌酐及尿素氮水平。取2組巴馬小型豬膀胱內(nèi)尿液10 mL，使用全自動尿液分析儀檢測尿液中尿蛋白水平。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色法檢測2組巴馬小型豬腎組織中TNF-α和IL-1α 表達(dá)2組巴馬小型豬處死后立即隨機取一側(cè)腎臟，生理鹽水灌注后用中性甲醛緩沖液固定，送醫(yī)院病理科進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片(厚 4 μm)。取腎組織切片，烤片脫蠟、水化；浸入酸堿度為6.0的檸檬酸鹽緩沖液中并在壓力鍋內(nèi)加熱進(jìn)行抗原熱修復(fù)4 min，蒸餾水沖洗2次，磷酸鹽緩沖溶液沖洗2次，每次3 min；再將切片浸泡于體積分?jǐn)?shù)3%內(nèi)源性過氧化物酶封閉，室溫靜置20 min，磷酸鹽緩沖溶液沖洗 3 次，每次 5 min；滴加兔抗IL-1α多克隆抗體(滴度1100)和兔抗TNF-α多克隆抗體(滴度1100)，4 ℃孵育過夜，滴加山羊抗兔免疫球蛋白G室溫孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。染色強度分為未染色(陰性)、淡黃色(弱陽性)、黃色 (陽性)、棕黃色 (強陽性)[12-15]。光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機取5個視野，計數(shù)每個視野內(nèi)TNF-α、 IL-1α強陽性及陽性細(xì)胞數(shù)及視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)，取均值。陽性細(xì)胞比例=(強陽性細(xì)胞數(shù)+陽性細(xì)胞數(shù))/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 HE染色法觀察2組巴馬小型豬腎組織病理學(xué)改變?nèi)∧I組織切片，將切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水洗、蘇木精和伊紅溶液依次染色、常規(guī)脫水、透明后，用中性樹膠封片，晾干后于光學(xué)顯微鏡下(×400)隨機選取5個視野觀察并拍照。分別計算每個視野下中性粒細(xì)胞浸潤、組織間隙水腫、腎小管壞死、淤血和微血栓所占面積的百分率，取均值，百分率越高表示腎組織病理學(xué)改變程度越嚴(yán)重。

1.3.5 Paller評分法評估2組巴馬小型豬腎小管病理損傷程度取經(jīng)HE染色并晾干后的腎組織切片，使用光學(xué)顯微鏡(×400)隨機選取5個視野觀察腎小管損傷程度，并采用Paller評分法[16]評估。Paller評分法評分標(biāo)準(zhǔn)：腎小管明顯擴張，細(xì)胞扁平計1分；刷狀緣損傷計1 分；刷狀緣脫落計 2 分；細(xì)胞質(zhì)空泡計1 分；間質(zhì)水腫計1 分；腎小管腔內(nèi)有脫落的壞死細(xì)胞，未形成管型或碎片計 1 分，形成管型或碎片計 2 分；Paller評分越高表示腎小管病理損傷程度越嚴(yán)重。

2 結(jié)果

2.1 2組巴馬小型豬核心體溫、結(jié)膜炎色和生理反射變化模型組巴馬小型豬熱暴露時間為(4.17±0.24)h，核心體溫達(dá)到42 ℃的時間為(3.17±0.41)h，造模成功時核心體溫為(43.25±0.29)℃，均出現(xiàn)結(jié)膜充血及提睪反射、角膜反射明顯減弱或消失。模型組巴馬小型豬熱暴露時間內(nèi)，對照組巴馬小型豬核心體溫為(38.25±0.15)℃，均未出現(xiàn)結(jié)膜充血，提睪反射、角膜反射減弱。

2.2 2組巴馬小型豬血清肌酐、尿素氮及尿蛋白水平比較結(jié)果見表1。模型組巴馬小型豬血清肌酐、尿素氮及尿蛋白水平顯著高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 2組巴馬小型豬血清肌酐、尿素氮及尿蛋白水平比較

2.3 2組巴馬小型豬腎組織中TNF-α、IL-1α表達(dá)比較結(jié)果見表2和圖1。免疫組織化學(xué)染色顯示，TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于近端腎小管中，模型組巴馬小型豬腎組織主要為棕黃色的強陽性染色，對照組巴馬小型豬腎組織主要為淡黃色的弱陽性染色。模型組巴馬小型豬腎組織中TNF-α、IL-1α陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表2 2組巴馬小型豬腎組織中TNF-α、IL-1α陽性細(xì)胞比例比較

：表示對照組巴馬小型豬腎組織中的弱陽性表達(dá)以及模型組巴馬小型豬腎組織中的陽性或強陽性表達(dá)。

2.4 2組巴馬小型豬腎臟病理學(xué)改變程度比較結(jié)果見表3和圖2。HE染色顯示，對照組巴馬小型豬腎組織中僅有少量中性粒細(xì)胞浸潤，未發(fā)現(xiàn)組織間隙水腫、淤血、微血栓形成及腎小管壞死；模型組巴馬小型豬腎組織中均出現(xiàn)明顯的組織間隙水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、淤血、微血栓形成及腎小管壞死，淤血和微血栓形成、中性粒細(xì)胞浸潤主要發(fā)生于近端腎小管中。模型組巴馬小型豬腎組織中中性粒細(xì)胞浸潤、組織間隙水腫、腎小管壞死、微血栓所占面積百分率均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表3 2組巴馬小型豬腎臟病理學(xué)改變比較

A：對照組正常腎組織;B:模型組組織間隙水腫;C:模型組中性粒細(xì)胞浸潤;D:模型組微血栓;E：模型組腎小管壞死。

2.5 2組巴馬小型豬Paller評分比較對照組和模型組巴馬小型豬Paller評分分別為(0.80±0.18)、(5.00±0.33)分。模型組巴馬小型豬的Paller評分顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=27.111，P<0.05)。

3 討論

人體持續(xù)暴露于高溫高濕環(huán)境中，體溫調(diào)節(jié)功能會受損，易出現(xiàn)中暑癥狀甚至發(fā)展成熱射病，其中運動員、戶外勞工和軍人患病的風(fēng)險最大[17]。重度中暑具有臨床癥狀重、進(jìn)展快、病死率高的特點。研究表明，重度中暑的發(fā)生受環(huán)境因素及高代謝因素影響[18]。通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，近年來在國內(nèi)幾乎沒有對重度中暑大型動物建模的研究，多采用小鼠進(jìn)行建模，但小型動物具有局限性，對于一些特殊的干預(yù)條件無法滿足(如血液凈化等)；國外有關(guān)重度中暑的研究多采用狒狒，但成本高且不易獲取。有研究表明，大型動物的免疫系統(tǒng)與人類類似，其中豬與人類的免疫系統(tǒng)有80%以上的共同點，且豬對內(nèi)毒素休克比較敏感，是腎臟研究中最受歡迎的大型動物之一[19-21]。本研究選擇雄性巴馬小型豬為研究對象，在研究重度中暑動物腎損傷方面具有一定的先進(jìn)性。

本研究借鑒了國內(nèi)外重度中暑動物模型構(gòu)建的實驗方法及診斷標(biāo)準(zhǔn)，通過模擬高溫高濕環(huán)境構(gòu)建豬重度中暑模型。本研究中模型組巴馬小型豬熱暴露時間為(4.17±0.24)h，核心體溫達(dá)到42 ℃的時間為(3.17±0.41)h，造模成功時核心體溫為(43.25±0.29)℃，且均出現(xiàn)結(jié)膜充血及提肛反射、角膜反射明顯減弱或消失，說明本研究成功構(gòu)建早期重度中暑模型[11]。

本研究結(jié)果顯示，模型組巴馬小型豬的血清肌酐、尿素氮及尿蛋白水平均顯著高于對照組，說明高溫高濕環(huán)境對巴馬小型豬腎功能造成明顯的損傷。腎臟是重度中暑所致多器官功能障礙的重要靶器官。重度中暑會導(dǎo)致AKI甚至急性腎衰竭，這與局部炎癥反應(yīng)和全身炎癥反應(yīng)有著密切的關(guān)系。有研究表明，重度中暑患者會出現(xiàn)全身性炎癥反應(yīng)綜合征、彌散性血管內(nèi)凝血，甚至是多器官功能障礙綜合征[22]。重度中暑的嚴(yán)重程度很大程度上取決于促炎因子水平和炎癥反應(yīng)發(fā)展的程度，如果不在早期進(jìn)行干預(yù)，重度中暑患者很快就會死亡[23]。AKI在病理生理學(xué)上表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)、免疫損傷、氧化應(yīng)激、腎灌注減少以及細(xì)胞死亡和凋亡等[24-25]。AKI發(fā)生后，腎臟和其他組織中受損的細(xì)胞會釋放預(yù)警因子和致病因子[26]，預(yù)警因子和致病因子與腎臟細(xì)胞和白細(xì)胞表面識別受體結(jié)合可誘導(dǎo)有促炎功能的M1型巨噬細(xì)胞活化，活化后的M1型巨噬細(xì)胞會分泌如IL-1α、IL-6和TNF-α等一系列促炎細(xì)胞因子及活性氧，進(jìn)而促進(jìn)AKI的發(fā)展[27]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1α陽性表達(dá)細(xì)胞主要分布于近端腎小管中，且模型組巴馬小型豬腎組織中TNF-α、IL-1α陽性細(xì)胞比例顯著高于對照組，這表明早期重度中暑即可使腎組織中IL-1α和TNF-α水平明顯升高，進(jìn)而可能促進(jìn)AKI的發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，模型組巴馬小型豬腎組織中均出現(xiàn)明顯的組織間隙水腫、中性粒細(xì)胞浸潤、淤血、微血栓形成和腎小管壞死，其中，淤血、微血栓形成和中性粒細(xì)胞浸潤主要發(fā)生于近端腎小管中，且模型組巴馬小型豬的Paller評分顯著高于對照組，說明重度中暑巴馬小型豬早期腎組織即出現(xiàn)不同程度的病理損傷。其原因可能是由于除了炎癥因子對重度中暑腎組織產(chǎn)生損傷外，腎組織中形成的廣泛淤血及微血栓也參與了早期腎損傷的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，重度中暑巴馬小型豬早期腎組織即出現(xiàn)明顯的病理學(xué)改變及腎功能損傷，且腎組織中IL-1α和TNF-α表達(dá)水平明顯升高。