熱處理對“隴藜1號”藜麥分離蛋白二級結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的影響

趙愛萍，何興芬，陳 娟，楊富民,*

（1.隴東學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院，甘肅 慶陽 745000；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）是一種偽谷物，已在安第斯山脈種植了數(shù)千年[1]。在我國，藜麥的種植歷史可以追溯到1987年[2]。藜麥蛋白質(zhì)含量高（約15%）[3]，必需氨基酸平衡[4]。與谷物和豆類相比，藜麥的氨基酸譜更廣[5]。與其他谷物蛋白質(zhì)類似，藜麥的蛋白質(zhì)成分包括白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。在過去的十年中，藜麥因其高營養(yǎng)價值和優(yōu)良的蛋白質(zhì)品質(zhì)而受到關(guān)注[6]，如果蔬-開菲爾藜麥發(fā)酵混合凍干食品[7]。此外，動物蛋白往往會產(chǎn)生致敏性，因此使用藜麥蛋白等植物蛋白作為部分替代品是當(dāng)下食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展的趨勢[8]。植物蛋白因其特定的結(jié)構(gòu)和功能特性，在食品工業(yè)中發(fā)揮著重要作用。有關(guān)新的植物蛋白質(zhì)來源和加工對這些蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性影響的研究越來越受到關(guān)注，并變得十分重要。因此，在食品工業(yè)中，藜麥在作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)提取原料的應(yīng)用中具有巨大的潛能[2]。

人們通常將藜麥種子置于過量的水中煮沸后食用。熱處理是最常見的處理方法，用于改變從不同來源獲得的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能特性[9]。它會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，即由于非共價氫鍵、疏水和靜電相互作用和/或共價交聯(lián)的變化，從天然狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序狀態(tài)[10]，蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)經(jīng)不同時間和溫度的熱處理會導(dǎo)致其營養(yǎng)價值和功能特性顯著改變。因此，在食品研究和生產(chǎn)中需對熱處理條件進行嚴(yán)格的把控[11]。而蛋白質(zhì)的功能特性可能與其二級結(jié)構(gòu)有關(guān)。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）是獲得蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的非常強大的工具[12]。通過適當(dāng)擬合蛋白質(zhì)原始FTIR的酰胺I譜帶，并分析其二階導(dǎo)數(shù)，可以獲得蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)（α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲）的相對含量[13]。齊寶坤等[14]報道稱蛋白質(zhì)的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲可以促進熱聚集體的形成。但目前有關(guān)熱處理對“隴藜1號”藜麥蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。本研究通過分析不同溫度、時間熱處理下藜麥分離蛋白（QPI）的熱重分析（TGA）特性及FTIR變化，表征熱處理對其熱穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)的影響，旨在為“隴藜1號”藜麥的加工及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

“隴藜1號”藜麥，2017年9月采收于甘南藏族自治州，真空包裝脫殼后的藜麥籽粒儲藏在干燥、避光環(huán)境下，直至使用。

石油醚（30~60℃），pH 7.0磷酸鹽緩沖液（PBS），1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl，KBr，以上試劑均為分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

FTIR 920傅里葉變換紅外光譜儀，天津市拓普儀器有限公司；TGA 550熱重分析儀，美國TA儀器有限責(zé)任公司；LyoQuest-85真空冷凍干燥機，河南兄弟儀器設(shè)備有限公司；H-1850 R高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；FW-100超高速萬能粉碎機，西安儀創(chuàng)實驗室儀器設(shè)備有限公司；LDZX-50 KBS立式高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；HH-M4水浴鍋，上海赫田科學(xué)儀器公司；PHS-3E型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 QPI的制備和保存

粉碎后的藜麥粉過60目篩，脫脂3次（30~60℃石油醚），每次3 h，置于通風(fēng)櫥風(fēng)干后按一定料液比加入蒸餾水，并用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至10，在47℃下提取2 h，以5 000 r/min下離心15 min，取上清液，用1 mol/L HCl將其pH調(diào)至4.5，4℃靜置2 h后以5 000 r/min離心15 min，收集沉淀。用蒸餾水將沉淀復(fù)溶后水洗5次，調(diào)節(jié)pH至中性，透析后真空冷凍干燥得到藜麥分離蛋白[15]。所得QPI純度為87.17%。

1.2.2 QPI溶液熱改性產(chǎn)物的制備

將QPI溶解在磷酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH 7.0）中，同時在環(huán)境溫度（25℃）下攪拌2 h，并在4℃下儲存過夜以增強水合作用。使用濃度為5%的QPI溶液分別在60、70、80、90、100、121℃溫度下處理5、10、20、30 min，然后用冰水快速冷卻5 min。樣品在4℃下儲存，一般在處理后2 d內(nèi)進行分析[16]。

1.2.3 熱重分析

稱取“1.2.2”中處理30 min的QPI熱改性產(chǎn)物10.0 mg于鉑銠合金托盤中，掃描速率和溫度范圍分別設(shè)置為50℃/min和50~700℃，對其在氮氣環(huán)境中進行熱重分析[17]。

1.2.4 傅里葉紅外光譜

稱取冷凍干燥后的QPI熱改性產(chǎn)物冷1.0 mg，并與200 mg KBr充分研磨，制成薄片上機測定。測定條件為：波數(shù)4 000~400 cm-1，分辨率4 cm-1，精度0.01 cm-1，掃描次數(shù)64次，溫度為25℃[18]。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Oringin 2021軟件作圖，使用Peak Fit V4.12軟件對傅里葉變換紅外光譜進行高斯擬合并分析其二階導(dǎo)數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱重分析測定結(jié)果

由圖1可見，隨著熱重分析溫度的升高，所有樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降趨勢相似，分為3個階段，分別為50~200℃，200~400℃和400~650℃。經(jīng)過不同溫度（60~121℃）處理30 min后的QPI熱穩(wěn)性均有所提高，且在121℃下處理30 min時有達(dá)到最大值。

圖1 不同熱處理條件對QPI熱重的影響Fig.1 Effects of different heating treatment conditions on thermo-gravimetric of QPI

2.2 傅里葉紅外光譜圖分析

由圖2可見，不同熱處理條件下的QPI其傅里葉紅外光譜圖存在很大差異。FTIR可以顯示出蛋白質(zhì)中的氨基基團、酰胺I帶、酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶等信息[19]。酰胺I帶（1 700~1 600 cm-1）和酰胺Ⅲ帶（1 320~1 230 cm-1）之間存在一定的對應(yīng)關(guān)系[20]。利用高斯擬合二階導(dǎo)數(shù)法對FTIR譜圖中的酰胺I、Ⅲ帶細(xì)分，得到QPI中4種二級結(jié)構(gòu)的含量[21]。

圖2 不同熱處理條件對QPI傅里葉紅外光譜圖的影響Fig.2 Effects of different heating treatment conditions on FTIR spectra of QPI

據(jù)報道，蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶中4種二級結(jié)構(gòu)與波譜的對應(yīng)關(guān)系分別為：1 640~1 610 cm-1對應(yīng)β-折疊，從1 670~1 660 cm-1對應(yīng)β-拐角，1 658~1 650 cm-1對應(yīng)α-螺旋，1 650~1 640 cm-1對應(yīng)無規(guī)則卷曲[22]。圖3為QPI的去卷積酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜，QPI的4種二級結(jié)構(gòu)含量最終由積分面積得出。

圖3 QPI的去卷積酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜Fig.3 The second-derivative spectra of deconvolution amide I in QPI

酰胺Ⅰ帶各二級結(jié)構(gòu)相對含量擬合結(jié)果見圖4。由圖4可見，不同熱處理對QPI酰胺Ⅰ帶二級結(jié)構(gòu)的相對含量影響較大。在同一溫度下隨著熱處理時間的延長，QPI酰胺Ⅰ帶中的α-螺旋含量呈逐漸降低的趨勢，在100℃處理30 min時含量最低，為25.11%；β-轉(zhuǎn)角含量在60、70、100、121℃處理下則與α-螺旋含量呈現(xiàn)相反的趨勢（圖4A、B、E、F），在100℃處理30 min時含量最高，為40.59%，而在80℃與90℃處理下隨著熱處理時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢（圖4C、D）；在同一溫度下，β-折疊含量隨熱處理時間的延長呈先降低后升高的趨勢，在100℃處理20 min時含量最低，為24.22%；無規(guī)則卷曲含量在熱處理過程中同樣發(fā)生變化，但是較其他3種結(jié)構(gòu)而言，其變化不顯著。

圖4 利用酰胺Ⅰ帶擬合不同熱處理條件制備的QPI二級結(jié)構(gòu)含量Fig.4 The secondary structures contents of QPI prepared by different heat treatment conditions fitted through amide I bands

酰胺Ⅲ帶的譜峰歸屬如下：1 330~1 290 cm-1為α-螺旋；1 295~1 265 cm-1為β-轉(zhuǎn)角；1 270~1 245 cm-1為無規(guī)卷曲；1 250~1 220 cm-1為β-折疊[23]。圖5為QPI的去卷積酰胺Ⅲ帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜。

圖5 QPI的去卷積酰胺Ⅲ帶二階導(dǎo)數(shù)擬合圖譜Fig.5 The second-derivative spectra of deconvolution amideⅢin QPI

根據(jù)圖6酰胺Ⅲ帶擬合不同熱處理條件制備的藜麥分離蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量可以看出，不同熱處理對QPI酰胺Ⅲ帶二級結(jié)構(gòu)有顯著影響。在80、100℃下隨著熱處理時間的延長，QPI酰胺Ⅲ帶中的α-螺旋含量呈先上升后下降的趨勢，在60、90℃下呈逐漸上升趨勢，而在60、121℃下呈先升高后下降再升高的趨勢，在80℃下處理30 min時含量最低，為9.02%；β-轉(zhuǎn)角含量則與α-螺旋含量呈現(xiàn)相反的趨勢，在100℃下處理20 min時含量最高，為12.92%；β-折疊含量在60、70、90、100、121℃下隨熱處理時間的延長呈先上升后下降的趨勢，在80℃時呈現(xiàn)先上升趨勢，在90℃下處理20 min時含量最低，為40.80%；無規(guī)則卷曲含量在熱處理過程中同樣發(fā)生變化，呈先下降后上升，在80℃下處理30 min時含量最高，為36.49%。

圖6 利用酰胺Ⅲ帶擬合不同熱處理條件制備的QPI二級結(jié)構(gòu)含量Fig.6 The secondary structures contents of QPI prepared by different heat treatment conditions fitted through amideⅢbands

3 討論

3.1 熱處理對QPI熱重特性的影響

TGA結(jié)果表明，經(jīng)過不同溫度（60、70、80、90、100、121℃）處理30 min后的QPI熱穩(wěn)性均有所提高，且在121℃下處理30 min時有最大值。所有樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降趨勢相似，分3個階段，分別為：50~200℃，200~400℃和400~650℃。由于熱處理后QPI的熱穩(wěn)定性得到提升，導(dǎo)致熱處理的QPI熱量損失較低，這與Zhang等[24]在研究蒸汽爆破處理對山茶（Camellia oleifera Abel.）種餅蛋白的熱重特性時也觀察到的趨勢類似。第一階段的質(zhì)量主要損失在殘留水和低分子量揮發(fā)物上。第二階段的質(zhì)量損失主要歸因于蛋白質(zhì)的降解，在此降解階段，分子間和分子內(nèi)的氫鍵、靜電和疏水相互作用等的非共價鍵裂解以及氨基酸殘基之間的共價鍵斷裂共同導(dǎo)致這一階段的質(zhì)量損失[25]。第三個降解中QPI的質(zhì)量損失斜率變小了，這可能是由于氣流下蛋白質(zhì)分離物的氧化所致。這與Malik等[26]的研究結(jié)果一致。

3.2 熱處理對QPI二級結(jié)構(gòu)含量的影響

在同一溫度下，藜麥分離蛋白中α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)的含量隨著熱處理時間的延長整體呈降低的趨勢，而β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲相對含量逐漸增加，表明藜麥蛋白分子的α-螺旋和β-折疊向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲轉(zhuǎn)變。這可能是因為加熱破壞了QPI分子間的氫鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)最為緊密的α-螺旋結(jié)構(gòu)聚集，而蛋白質(zhì)內(nèi)部的β-折疊隨之展開，形成無序松散的無規(guī)卷曲[27]。蛋白質(zhì)變性的典型表現(xiàn)之一即為出現(xiàn)更多的無序結(jié)構(gòu)。有研究表明，大豆蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的相對含量隨著熱處理時間的延長逐漸減少，而無規(guī)卷曲相對含量則增多[14]。因此，認(rèn)為無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角可以促進熱聚集體的形成。酰胺Ⅲ帶各二級結(jié)構(gòu)擬合結(jié)果中，由于在同一溫度下隨著熱處理時間的延長，導(dǎo)致維持α-螺旋的氫鍵作用減弱，使其逐漸解旋，隨處理時間的進一步延長，導(dǎo)致展開后的蛋白重新排列，使得α-螺旋含量增多，相應(yīng)的無規(guī)卷曲含量減少。

4 結(jié)論

從熱穩(wěn)定性和二級結(jié)構(gòu)的角度研究了熱處理后的藜麥分離蛋白，結(jié)果表明：熱處理的QPI熱穩(wěn)性高于未處理組，且熱處理溫度越高其熱穩(wěn)定性越好；熱處理導(dǎo)致QPI分子內(nèi)的α-螺旋聚集，β-折疊展開，形成更多松散的無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，說明通過調(diào)節(jié)熱處理條件可以改善QPI的熱穩(wěn)定性，同時改變QPI的二級結(jié)構(gòu)，為QPI的進一步加工利用提供理論依據(jù)。但熱處理對QPI功能性質(zhì)的影響以及結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)之間的關(guān)系還需進一步探究。