牛乳和駝乳中酪蛋白的差異蛋白組學(xué)分析

豆智華，楊迎春，姚懷兵，楊潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

0 引言

近年來，人們對(duì)駝乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的認(rèn)知度越來越高，但駝乳產(chǎn)量低、奶源不穩(wěn)定等因素造成巨大的供需矛盾和懸殊的價(jià)格差異，使得駝乳及其乳制品極易遭受摻假。到目前為止，對(duì)于駝乳及制品的真實(shí)性分析鑒定并沒有明確的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立準(zhǔn)確、快速鑒別駝乳及其乳制品中牛源性成分的檢測(cè)方法，為保障駱駝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。目前已有多種技術(shù)運(yùn)用于乳蛋白的分析，如毛細(xì)管電泳[1]、雙向電泳[2]、反向高效液相色譜[3]、質(zhì)譜[4]及液質(zhì)聯(lián)用[5]等，本文主要利用雙向電泳技術(shù)對(duì)牛乳和駝乳中酪蛋白進(jìn)行差異性分析，并利用質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF-MS)來對(duì)差異性蛋白進(jìn)行鑒定，并以此為標(biāo)識(shí)物建立駝乳中牛源性成分的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選擇新疆烏魯木齊紅雁池的哈族村自然放牧的10峰雙峰駱駝乳，現(xiàn)場(chǎng)采集駝乳混勻后用低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室，-20oC中保存?zhèn)溆?。牛乳采自新疆農(nóng)十二師五一農(nóng)場(chǎng)飼養(yǎng)的奶牛，低溫保存帶回實(shí)驗(yàn)室于-20oC中保存?zhèn)溆谩?/p>

ImmobilineTMDryStrip pH3-10 NL（13cm），GE公司；IPG Buffer，GE公司；TEMED，Tris-base、SDS、Acr、Bis、硫脲、溴酚藍(lán)、尿素、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、過硫酸銨、甘氨酸(Gly)、低熔點(diǎn)瓊脂糖、午睡乙醇、冰醋酸、蛋白質(zhì)染色試劑盒（SK3011），均購(gòu)自上海生物工程有限公司；低背景銀染試劑盒（BSP027），美國(guó)G-Biosciences；CHCA（貨號(hào)：034K3707），Sigma；乙腈（A酪蛋白）（貨號(hào)：1499230-935）。三氟乙酸（TFA）（貨號(hào)：S6002262-009）,Merck；Mass Standards Kit for Proteomics Analyzer（貨號(hào)：43336 04），ABI。

1.2 儀器與設(shè)備

HeraeusMultifuge8R離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；ALPHA1-2LD真空冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Martin CHRIST公司；MDD-U53V超低溫冰箱，日本SANEYO公司；分光光度儀，UV1800，美譜達(dá)儀器公司；純水儀，摩爾公司；超聲細(xì)胞破碎儀，浙江新芝；SE-600全套電泳設(shè)備，GE公司；光密度掃描儀，GE公司；冷卻水循環(huán)系統(tǒng)，GE公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白提取

取4oC冰箱中解凍的駝乳、牛乳樣品100 mL，離心15 min（3 500 r/min），去除上層脂肪（可重復(fù)離心兩次），得到脫脂乳；再用10%乙酸調(diào)pH至4.6，放置4oC冰箱過夜；12 000 r/min離心15 min，去除上層的脂肪，沉淀即為酪蛋白；冷凍干燥備用。利用試劑盒對(duì)電泳蛋白樣品進(jìn)行清潔，試劑盒為上海生工的Perfect-FOCUSTM2D試劑（786-124）。

1.3.2 蛋白定量

使用蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（SK3071，上海生工生物工程股份有限公司）對(duì)蛋白樣品的蛋白質(zhì)含量的進(jìn)行測(cè)定。將樣品分裝為60μg，-80℃保存。

1.3.3 蛋白樣品的雙向電泳

第一向等電點(diǎn)聚焦（IEF）：采用預(yù)制IPG（Immobilized pHGradient）干膠條（pH 3～10,13 cm），蛋白上樣量為60μg。將蛋白樣品與水化液混勻后加入IPG水化盤，將IPG膠條完全放入樣品溶液后，20℃左右過夜水化(至少20 h)后進(jìn)行等電聚焦電泳，設(shè)置膠條等電點(diǎn)聚焦（IPGphor）儀器的運(yùn)行依據(jù)。等電點(diǎn)聚焦參數(shù)見表1。

表1 等電聚焦電泳參數(shù)

第二向SDS-PAGE電泳：等電點(diǎn)聚焦結(jié)束后，將膠條分別放在10 mL的平衡液I（含100 mg DTT）和10 mL的平衡液II中（含250 mg碘乙酰胺）分別平衡15 min。平衡結(jié)束后，用電極緩沖液潤(rùn)洗1～2 s，進(jìn)行SDS-PAGE。當(dāng)溴酚藍(lán)遷移至膠底部0.5 cm處停止電泳，然后進(jìn)行凝膠染色，每個(gè)蛋白樣品至少重復(fù)3次，用Image MasterTM2D Platinum進(jìn)行2-DE圖譜的分析。

1.3.4 蛋白斑點(diǎn)的脫色

使用ImageMaster（7.0）對(duì)于2-DE圖譜進(jìn)行掃描、斑點(diǎn)的檢測(cè)、匹配和差異蛋白斑點(diǎn)的分析，將差異蛋白斑點(diǎn)從凝膠中扣取1～2 mm2大小的膠塊放入Eppendorf管中。用超純水沖洗膠塊，沖洗2～3次，每次10 min。每管加入400μL碳酸氫銨（濃度100 mmol/L）或質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%乙腈進(jìn)行凝膠塊的脫色。脫色結(jié)束后A酪蛋白脫水至白色后真空抽干。

1.3.5 MALDI-TOF/TOF-MS質(zhì)譜分析

將凍干后的酶解樣品加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%乙腈復(fù)溶，待樣品完全溶解后取出1μL加樣于樣品靶上，使其自然干燥。質(zhì)譜條件：Nd:YAG激光器光源波長(zhǎng)為355 nm，肽指紋圖譜質(zhì)量掃描范圍為800～4 000 u，加速電壓為2 kV，采集數(shù)據(jù)，二級(jí)質(zhì)譜激光需激發(fā)2 500次，2 kV碰撞能量時(shí)關(guān)閉CID，按單個(gè)樣品點(diǎn)8個(gè)母離子的原則選擇。

1.3.6 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及生物信息學(xué)分析

2-DE圖譜用GPS軟件進(jìn)行檢索，用MASCOT搜索引擎，在NCBInr 20131103數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索；用http://www.matrixscience.com/來分析和鑒定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量等相關(guān)的信息。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋白質(zhì)的定量

如圖1所示，通過圖中的線性方程Y=-0.0092x+0.8736來進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量分析。根據(jù)蛋白樣品的吸光度值，計(jì)算待測(cè)樣品的質(zhì)量濃度，駝乳酪蛋白的質(zhì)量濃度為2.23 g/L，牛乳酪蛋白的質(zhì)量濃度為8.20 g/L。

圖1 蛋白質(zhì)量濃度定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 駝乳和牛乳中酪蛋白的雙向電泳

在相同條件下，利用2-DE技術(shù)對(duì)牛乳和駝乳中酪蛋白分別進(jìn)行了分離分析，為提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性，每個(gè)酪蛋白樣品至少重復(fù)了3次，獲得的2-DE圖譜具有較好的重復(fù)性，可以滿足實(shí)驗(yàn)的要求。牛乳和駝乳中酪蛋白質(zhì)的2-DE凝膠圖譜如圖2所示，駝乳、牛乳酪蛋白的2-DE圖譜中蛋白斑點(diǎn)分布大致相同，可以滿足比較蛋白質(zhì)組學(xué)差異性分析的實(shí)驗(yàn)要求。經(jīng)掃描成像及Image Master軟件分析，在相同條件下進(jìn)行的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，牛乳酪蛋白中可檢測(cè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)為512，546，573；駝乳酪蛋白中可檢測(cè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為525，521，631如表2所示。

表2 牛乳和駝乳酪蛋白2-DE凝膠斑點(diǎn)數(shù)

圖2 牛乳和駝乳中酪蛋白質(zhì)的2-DE凝膠圖譜

2.3 部分差異蛋白斑點(diǎn)的局部分析和表達(dá)量化柱狀圖

由雙向電泳結(jié)果可知，與牛乳中的酪蛋白相比，駝乳酪蛋白中缺失33個(gè)蛋白點(diǎn)，且7個(gè)蛋白點(diǎn)顯示為低表達(dá)，圖3為牛乳與駝乳酪蛋白部分差異蛋白斑點(diǎn)的局部放大分析和表達(dá)量化圖。由圖3可知，駝乳和牛乳中酪蛋白的之間確實(shí)存在一定的差異性。用軟件分析掃描后得到的圖像、結(jié)合人工分析比對(duì)，發(fā)現(xiàn)牛乳和駝乳酪蛋白的2-DE凝膠圖譜中，能夠匹配且表達(dá)量比值高于2或低于0.5的差異蛋白斑點(diǎn)有40個(gè)。與牛乳酪蛋白相比，駝乳酪蛋白中有7個(gè)蛋白斑點(diǎn)表現(xiàn)為低表達(dá)，33個(gè)蛋白斑點(diǎn)表達(dá)缺失，其中10、11、13、16、63、64、127為駝乳中低表達(dá)的酪蛋白斑點(diǎn)。

圖3 部分差異蛋白斑點(diǎn)局部放大和表達(dá)量化

2.4 在駝乳酪蛋白中低表達(dá)蛋白質(zhì)譜鑒定

與牛乳酪蛋白相比，在駝乳酪蛋白中低表達(dá)的蛋白斑點(diǎn)（10，11，13，16，63，64，127）進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，我們成功回收考了馬斯亮藍(lán)染色的2-DE圖譜中的5個(gè)蛋白斑點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)酶解質(zhì)譜鑒定，人工數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)5個(gè)蛋白斑點(diǎn)為3種酪蛋白，分別是酪蛋白2、κ-酪蛋白A片段、β-酪蛋白見表3。

表3 駝乳酪蛋白中低表達(dá)酪蛋白斑點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定

3 討論

文獻(xiàn)記載，駝乳中酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)一般為1.63%～2.76%，一般以β-酪蛋白(65%)和ɑs1-酪蛋白(21%)為主，其中β-酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)(65%)要高于牛乳(36%)，與人乳中β-酪蛋白含量相似[6]。同時(shí)與其他物種的乳相比，駝乳中含有豐富的α-乳白蛋白，缺乏β-乳球蛋白，具有與母乳相似的蛋白結(jié)構(gòu)。因此駝乳的消化利用率更高且發(fā)生過敏反應(yīng)的概率更低[7]。駝乳中酪蛋白與牛乳酪蛋白在一級(jí)結(jié)構(gòu)上有所差異，但二級(jí)結(jié)構(gòu)卻極為相似，研究分析這可能與駝乳酪蛋白中具有高脯氨酸的含量有關(guān)[8]。Farah和Farah-Riesen等利用電泳技術(shù)發(fā)現(xiàn)單峰駱駝乳酪蛋白中含有α-酪蛋白和β-酪蛋白，卻沒有發(fā)現(xiàn)與牛乳中κ-酪蛋白相似的蛋白條帶[9]。Naima Alim等研究證實(shí)阿爾及利亞單峰駝和Targui的單峰駝的駝乳中的駝乳酪蛋白中基本不含有κ-酪蛋白或含量極低[10]。Zhang等對(duì)發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古阿拉善雙峰駝乳中含有ɑs1-酪蛋白,ɑs2-酪蛋白、β-酪蛋白，不含有κ-酪蛋白或含有少量的κ-酪蛋白[11]。

目前的研究表明駝乳酪蛋白中的主要生物活性成分為β-酪蛋白，Maryam和劉辰等分別發(fā)現(xiàn)駝乳中的酪蛋白和β-酪蛋白在與胃蛋白酶和蛋白酶的混合物水解后顯示高ACE抑制活性[12-13]。因此認(rèn)為駱駝乳中的β-酪蛋白可以作為一種天然的抗高血壓和抗氧化的一種新型食物而發(fā)揮重要作用。蘇德奇等研究發(fā)現(xiàn)駝乳酪蛋白和乳清蛋白及其降解產(chǎn)物可以對(duì)肝細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用，主要是通過清除超氧化物、羥基自由基、和抑制脂類氧化等的作用來增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化的能力[14-15]。

4 結(jié)束語

本研究基于駝乳中酪蛋白含量豐富、穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)，以駝乳和牛乳酪蛋白之間的差異蛋白為為摻假檢測(cè)標(biāo)識(shí)物，建立駝乳中牛源性成分的檢測(cè)方法，來滿足駝乳及其他乳制品的檢測(cè)需求。利用酪蛋白檢測(cè)駝乳中摻假的牛乳這一方法中旨在針對(duì)駝乳及乳制品真實(shí)性問題，建立準(zhǔn)確、快速鑒別駝乳及其乳制品中牛源性成分的檢測(cè)方法，制訂駝乳真實(shí)性鑒別的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，解決駱駝產(chǎn)業(yè)發(fā)展中的“卡脖子”問題，為保障駝乳產(chǎn)品的質(zhì)量、維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、遏制食品安全問題的發(fā)生、保障駱駝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。