干酪乳桿菌Zhang在不同溫度下的膜脂肪酸變化分析

包秋華，代利霞，梅邇藍(lán)

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018)

0 引言

益生菌菌株在食品工業(yè)中的成功應(yīng)用取決于它們的功能特性，而功能特性的發(fā)揮需要保證益生菌菌株以存活狀態(tài)進(jìn)入人體腸道[1]。乳酸菌在生產(chǎn)和應(yīng)用過(guò)程中不可避免會(huì)受到不利于生存的環(huán)境條件變化的影響，如溫度、酸堿度、滲透壓、射線、寡營(yíng)養(yǎng)、電解質(zhì)和氧化劑等[2]。這些因素可能會(huì)引起乳酸菌基因型和表型發(fā)生一系列的生理變化[3]。其中溫度是對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)最具影響的環(huán)境因素。當(dāng)在最適生長(zhǎng)溫度下，繁殖速率最快，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，生長(zhǎng)狀態(tài)最好，當(dāng)高于或低于最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，乳酸菌會(huì)激活多種應(yīng)激反應(yīng)去應(yīng)對(duì)不利生存的條件來(lái)抵抗脅迫[4-7]。Hermien V B[8]將植物乳桿菌置于28℃和40℃進(jìn)行溫度脅迫，發(fā)現(xiàn)兩種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子有助于調(diào)節(jié)菌株對(duì)溫度脅迫的抗性，進(jìn)而對(duì)其應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行闡述。Correa D M A[9]對(duì)鼠李糖乳桿菌CRL 1505進(jìn)行了耐熱性研究，55℃下處理20 min，細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著變化，顯示出了高的內(nèi)在耐熱性可見菌體對(duì)此逆境條件產(chǎn)生了耐熱機(jī)制。

細(xì)胞膜是菌體與外界環(huán)境隔離的主要屏障，當(dāng)溫度發(fā)生劇烈變化時(shí)，細(xì)胞膜是首先感知到外界環(huán)境壓力的部位，也是首先被傷害的目標(biāo)基質(zhì)，這種傷害體現(xiàn)在破壞細(xì)胞膜的完整性。研究發(fā)現(xiàn)微生物的自我調(diào)節(jié)機(jī)制與細(xì)胞膜不飽和脂肪酸也有密切關(guān)系，細(xì)胞膜中的不飽和脂肪酸含量的增加可以增強(qiáng)微生物在溫度變化過(guò)程中細(xì)胞膜的流動(dòng)性，起到維持細(xì)胞膜的功能，從而提高微生物的抗逆性[10-12]，張愛靜[13]通過(guò)熱脅迫處理E.coil ATCC43889菌株，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，個(gè)體形態(tài)變長(zhǎng)，生物被膜生成能力增強(qiáng)，飽和脂肪酸含量升高，不飽和脂肪酸含量下降，菌株耐熱性增強(qiáng)。乳酸菌在溫度變化過(guò)程中也可以通過(guò)改變細(xì)胞膜脂肪酸的含量與組分，調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的流動(dòng)性去維持菌株正常生長(zhǎng)，減免損傷[14-15]。李寶坤[16]通過(guò)對(duì)羅伊氏乳酸桿菌冷熱脅迫處理后，采用Bligh&Dyer法對(duì)脂肪酸進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)羅伊氏乳酸桿菌CICC 6226菌體中的不飽和脂肪酸比例上升，而在此條件下菌體的存活率也最高，推斷在冷熱脅迫條件下，羅伊氏乳酸桿菌對(duì)此逆境產(chǎn)生了保護(hù)機(jī)制，這種機(jī)制產(chǎn)生后會(huì)對(duì)細(xì)胞膜脂肪酸的含量及組分產(chǎn)生很大的影響，對(duì)微生物環(huán)境適應(yīng)性和應(yīng)激脅迫響應(yīng)機(jī)制的探究具有重要意義，對(duì)保障食品安全及企業(yè)面臨的生產(chǎn)問(wèn)題有一定的改善。

干酪乳桿菌Zhang（Lactobacillus casei Zhang，Lb.casei Zhang）是一株從傳統(tǒng)酸馬奶中分離的益生菌，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的科學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)該菌的生理特性、益生功效、分子機(jī)理、生產(chǎn)性能等一系列關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行了攻關(guān)研究，取得了重大突破，并證明了其安全性，且已市場(chǎng)化應(yīng)用[17-18]。本文通過(guò)研究逆境條件下干酪乳桿菌Zhang膜脂肪酸的變化，從而探究其是否具有抵御不良生存環(huán)境下的應(yīng)激機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：干酪乳桿菌Zhang（Lb.casei Zhang），內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫(kù)保存并提供。

試劑：液體MRS、固體MRS、生理鹽水、氯仿-甲醇溶液、氯仿、甲醇鈉-甲醇、正己烷。

1.2 儀器

DHP-9272恒溫培養(yǎng)箱，上海恒科有限公司；Eppendorf 5810 R離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋，日本三洋公司；氣相色譜儀6850型，美國(guó)Agilent公司；EYELA MG-2200氮吹儀，日本。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化

將Lb.casei Zhang以2%的接種量接入MRS液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，活化到第三代后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期的菌體通過(guò)革蘭氏染色進(jìn)行形態(tài)觀察和電鏡掃描觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.3.2 不同溫度條件Lb.casei Zhang的處理

將活化的菌液分裝到50 mL離心管中，5 000 g離心5 min，棄上清，加入適量生理鹽水洗菌，離心后收集菌泥，把預(yù)熱好的45、60、70℃MRS液體培養(yǎng)基分別倒入50 mL離心管中，在對(duì)應(yīng)溫度下對(duì)Lb.casei Zhang熱處理5、10、30 min，同時(shí)在37℃下做對(duì)照試驗(yàn)。

1.3.3 不同溫度條件Lb.casei Zhang活菌數(shù)量變化

在不同溫度條件下，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)Lb.casei Zhang在0、6、12、18 h的活菌數(shù)量，每次試驗(yàn)重復(fù)3次，每次試驗(yàn)3個(gè)平行。

1.3.4 膜脂肪酸的提取及甲酯化

對(duì)4種不同溫度處理的Lb.casei Zhang分別在0、6、12、18 h進(jìn)行取樣，并采用Bligh&Dyer法[16]提取細(xì)胞膜脂肪酸并進(jìn)行甲酯化。

1.3.5 脂肪酸組分和含量的測(cè)定

采用Agilent 6850氣相色譜儀對(duì)樣品進(jìn)行脂肪酸檢測(cè)。先用37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品(Supelco 47885-U)定標(biāo)，得到了能夠檢測(cè)37種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的最佳氣相檢測(cè)條件，然后通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)Lb.casei Zhang在不同溫度條件不同時(shí)間的細(xì)胞膜脂肪酸組分和含量，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

檢測(cè)條件：色譜柱為定制Agilent公司毛細(xì)填充管，填充物為（88%-氰丙基）芳基-聚硅氧烷，規(guī)格60 m×0.25 mm i.d×0.25μm film；載氣：氮?dú)?純度為99.999%)；進(jìn)樣口溫度：260℃；柱溫升溫程序：初始溫度80℃，保持1 min，隨后以6.5℃/min速率增至170℃，以2.75℃/min速率增至215℃，并保持2 min，以40℃/min速率增至230℃，并保持2 min；氫氣流量35 mL/min、空氣流量350 mL/min、氮?dú)饬髁?5 mL/min；檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度260℃；進(jìn)樣量1μL，分流比1∶5。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

將待測(cè)樣本的脂肪酸色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖進(jìn)行分析比較，確定待測(cè)樣品中脂肪酸組分，并用面積歸一化法(以峰值面積的百分比表示)確定各種脂肪酸的百分含量[19]。上述所有數(shù)據(jù)均采用SPSS等軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 Lb.casei Zhang的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

將活化第三代的Lb.casei Zhang進(jìn)行革蘭氏染色和掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖1。

圖1 Lb.casei Zhang的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

通過(guò)圖1可以看出，Lb.casei Zhang為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，大小形態(tài)均一，沒(méi)有其他雜菌的圖樣，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Lb.casei Zhang在不同溫度條件下活菌數(shù)變化結(jié)果

對(duì)Lb.casei Zhang進(jìn)行不同溫度處理后，不同時(shí)間點(diǎn)的活菌數(shù)變化情況見圖2。結(jié)果顯示在不同溫度處理下，活菌數(shù)變化規(guī)律均不同。37℃和45℃處理時(shí)活菌數(shù)變化趨勢(shì)總體平穩(wěn)，變化幅度較小，但37℃在0～18 h內(nèi)先略微增加然后開始下降；60℃和70℃處理時(shí)活菌數(shù)在0～6 h出現(xiàn)大幅度下降，而在6～18 h出現(xiàn)緩慢降低，整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

圖2 不同溫度脅迫下Lb.casei Zhang活菌數(shù)變化結(jié)果圖

2.3 Lb.casei Zhang在不同溫度條件下膜脂肪酸組分和含量的檢測(cè)

通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)Lb.casei Zhang在不同溫度條件下不同時(shí)間點(diǎn)處理的脂肪酸，部分脂肪酸變化峰圖結(jié)果見圖3。從色譜圖的峰形、基線等方面看，數(shù)據(jù)很好，可信度高。

通過(guò)脂肪酸的氣相色譜圖可以看出脂肪酸含量發(fā)生了顯著變化。從圖3可以看出，Lb.casei Zhang在溫度為45℃處理0 h時(shí)油酸（C18∶1n9c）的峰高（出峰時(shí)間20.693 min）高于18 h（出峰時(shí)間20.673 min）的峰高。

圖3 Lb.casei Zhang在不同溫度條件下的脂肪酸氣相色譜圖

在不同溫度條件下，通過(guò)氣相色譜法測(cè)出主要發(fā)生變化的脂肪酸有5種∶肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1n9c）、亞油酸（C18∶2），這5種脂肪酸占總細(xì)胞膜脂肪酸的比例最大。不同溫度條件下飽和脂肪酸中以棕櫚酸為主，含量約占總細(xì)胞膜脂肪酸含量的28%，而不飽和脂肪酸中以亞油酸為主，占總膜脂肪酸含量的31.49%，脂肪酸種類見表1。

表1 Lb.casei Zhang的脂肪酸種類

2.4 不同溫度條件下Lb.casei Zhang細(xì)胞膜脂肪酸的變化分析

Lb.casei Zhang在不同溫度條件處理下不同時(shí)間點(diǎn)的膜脂肪酸相對(duì)百分含量變化，結(jié)果見表2。

表2 Lb.casei Zhang不同溫度下脂肪酸變化

（續(xù)表2）

由表2可見，Lb.casei Zhang在不同溫度下18 h內(nèi)細(xì)胞膜中含量相對(duì)較高的5種脂肪酸變化均顯著，其中棕櫚酸（C16:0）是Lb.casei Zhang細(xì)胞膜的主要飽和脂肪酸，變化范圍在(25.28±0.12)%～(33.03±0.60)%，其次是肉豆蔻酸（C14∶0）。亞油酸（C18∶2）是主要的不飽和脂肪酸，變化范圍在(28.49±0.47)%～(37.24±0.62)%。

2.4.1 37℃條件下Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

在37℃時(shí)，Lb.casei Zhang 5種脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量的對(duì)比分析，結(jié)果見圖4。

圖4 干酪乳桿菌Zhang在37℃條件下脂肪酸組分和含量變化

從圖4(a)可以看到，37℃條件下各脂肪酸相對(duì)百分含量隨時(shí)間的變化比較明顯，油酸（C18∶1n9c）和亞油酸（C18∶2）隨著時(shí)間的增加相對(duì)百分含量出現(xiàn)減少，而且變化浮動(dòng)較大，在6 h之后基本平穩(wěn)，僅出現(xiàn)略微的變化。肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）在0～6 h均出現(xiàn)了增幅，棕櫚酸（C16∶0）的增加幅度較大，且在6 h之后開始下降。此外，從圖4(b)中可以直觀的看出37℃條件下總飽和脂肪酸與總不飽和脂肪酸的相對(duì)百分含量變化，總不飽和脂肪酸在0～18 h內(nèi)先減少后出現(xiàn)了增加，但增加幅度較小，總飽和脂肪酸相反，呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。

2.4.2 45℃條件下Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

對(duì)Lb.casei Zhang在溫度為45℃時(shí)各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果見圖5。

圖5 干酪乳桿菌Zhang在45℃條件下脂肪酸組分和含量變化

從圖5（a）可以看到，45℃條件下各脂肪酸相對(duì)百分含量隨時(shí)間的變化，肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）和亞油酸（C18∶2）在0～6 h脂肪酸相對(duì)百分含量均出現(xiàn)了增加，油酸（C18∶1n9c）和棕櫚油酸（C16∶1）出現(xiàn)了下降，油酸的變化浮動(dòng)較大，在6 h之后基本平穩(wěn)，僅出現(xiàn)略微的變化。并且從圖5（b）中可以直觀的看到45℃下總飽和脂肪酸與總不飽和脂肪酸的變化，總不飽和脂肪酸在時(shí)間0～18 h內(nèi)先減少后增加，總體趨勢(shì)為增加，總飽和脂肪酸相反，先出現(xiàn)增加然后減少。

2.4.3 60℃條件下Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

對(duì)Lb.casei Zhang在溫度為60℃時(shí)各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果見圖6。

圖6 干酪乳桿菌Zhang在60℃條件下脂肪酸組分和含量變化圖

從圖6（a）可以看到，60℃條件下各脂肪酸相對(duì)百分含量隨時(shí)間的變化，肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1n9c）在0～6 h隨著時(shí)間的變化相對(duì)百分含量出現(xiàn)減少，亞油酸（C18∶2）相對(duì)百分含量出現(xiàn)增加，之后的變化也不顯著，并且從圖6（b）可以直觀的看出60℃下飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的變化，總不飽和脂肪酸在時(shí)間0～18 h內(nèi)逐漸增加，但增加幅度較小，總飽和脂肪酸相反，這一結(jié)論與Ma YL[20]的研究結(jié)果相似。

2.4.4 70℃條件下Lb.casei Zhang脂肪酸組分和含量變化

對(duì)Lb.casei Zhang在溫度為70℃時(shí)各脂肪酸相對(duì)百分含量以及總不飽和脂肪酸和總飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)果見圖7。

從圖7（a）可以看到，70℃條件下各脂肪酸相對(duì)百分含量隨時(shí)間的變化，棕櫚酸（C16:0）和油酸（C18:1n9c）在0～6 h先增加，從第6 h開始出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，然后在12 h呈現(xiàn)略微的增加，肉豆蔻酸（C14:0）和亞油酸（C18:2）隨著時(shí)間的增加相對(duì)百分含量出現(xiàn)減少—增加—減少的趨勢(shì)，而棕櫚油酸（C16:1）在0～18h內(nèi)相對(duì)百分含量的變化很微弱，且含量較低。此外，從圖7（b）中可以直觀的看出70℃下飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的變化，總不飽和脂肪酸在時(shí)間0～18 h內(nèi)先減少后出現(xiàn)了增加，但增加幅度較小，總飽和脂肪酸相反，先增加后減少。

圖7 干酪乳桿菌Zhang在70℃條件下脂肪酸組分和含量變化

3 討論

當(dāng)乳酸菌處于不同溫度脅迫下，它會(huì)激活多種應(yīng)激反應(yīng)去抵抗這些不適生長(zhǎng)溫度的脅迫，其中細(xì)胞膜脂肪酸組成與含量的改變是其中一種，是細(xì)菌在不利條件下保持生存能力的重要保證。本研究中通過(guò)對(duì)Lb.casei Zhang在45、60、70℃條件下進(jìn)行熱激處理，隨著處理溫度的升高，Lb.casei Zhang的存活率明顯降低；細(xì)胞膜脂中不飽和脂肪酸含量增加，而飽和脂肪酸含量減少，推斷Lb.casei Zhang在熱激處理?xiàng)l件下產(chǎn)生了抗逆性，為抵御高溫環(huán)境下的傷害，Lb.casei Zhang通過(guò)改變細(xì)胞膜脂肪酸組分和含量，增加細(xì)胞膜流動(dòng)性來(lái)適應(yīng)環(huán)境變化。這一結(jié)果與Vaessen E M J[21]，Haddaji N[22]等研究結(jié)果一致，乳酸菌在逆境條件下，發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)，SFA/USFA(飽和脂肪酸/不飽和脂肪酸）比率下降，以及細(xì)胞膜流動(dòng)性隨著處理溫度的升高而增加。阿根廷一位研究人員Gomez Z A[23]對(duì)8株嗜熱乳酸桿菌的脂肪酸組成和抗凍融性進(jìn)行了研究，在-20℃與37℃下反復(fù)凍融循環(huán)，測(cè)定細(xì)胞膜中脂肪酸的比例以及飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的變化，發(fā)現(xiàn)C19∶0的增加可以使細(xì)胞免受凍融損傷。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Lb.casei Zhang在45、60、70℃處理下，主要通過(guò)C18∶2(亞油酸）的增加來(lái)使細(xì)胞免受熱激損傷。Kentaro T[24]研究發(fā)現(xiàn)一些耐冷細(xì)菌響應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境變化也是通過(guò)調(diào)節(jié)它們的脂肪酸組成，因此脂肪酸組成的調(diào)節(jié)被認(rèn)為是維持膜流動(dòng)性所必需的。這也從側(cè)面解釋了我國(guó)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌Lb.casei Zhang對(duì)熱有一定耐受性的機(jī)理。

實(shí)際生活中我們會(huì)盡可能避免含乳酸菌的食品受到不利環(huán)境的影響，而在工業(yè)生產(chǎn)中，會(huì)有意將乳酸菌置于脅迫條件下，將乳酸菌接種到腌制食品中，也就是高滲透壓環(huán)境，可以提高乳酸菌不飽和脂肪酸的含量，降低飽和脂肪酸的含量，改善腌制食品的品質(zhì)以及風(fēng)味質(zhì)量[25]，而且經(jīng)過(guò)熱激處理的菌株，在制備發(fā)酵乳的過(guò)程中，會(huì)使發(fā)酵乳的后酸化顯著下降，對(duì)于提高發(fā)酵乳產(chǎn)品貨架期具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義[26]。利用這些脅迫響應(yīng)可以生產(chǎn)出高質(zhì)量的發(fā)酵食品，包括干酪、葡萄酒、酸奶、焙烤食品等。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)在不同溫度下對(duì)Lb.casei Zhang進(jìn)行脅迫處理，采用Agilen 6850氣相色譜儀和60米的色譜柱成功檢測(cè)了其脂肪酸種類和含量的變化，并對(duì)飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸相對(duì)百分含量進(jìn)行了研究。得到以下結(jié)論：在不同溫度脅迫下，主要發(fā)生變化的5種脂肪酸是肉豆蔻酸（C14∶0）、棕櫚酸（C16∶0）、棕櫚油酸（C16∶1）、油酸（C18∶1n9c）、亞油酸（C18∶2）。從相對(duì)百分含量上看，不飽和脂肪酸含量增加，飽和脂肪酸含量減少，推測(cè)Lb.casei Zhang為應(yīng)對(duì)不良環(huán)境變化，通過(guò)增加不飽和脂肪酸含量來(lái)改變細(xì)胞膜流動(dòng)性，增加細(xì)胞活性，起到了維持細(xì)胞膜的功能，從而提高了微生物的抗逆性，初步解析了Lb.casei Zhang具有抵御不良生存環(huán)境下的應(yīng)激機(jī)制。