病原菌多重耐藥與生物膜表型和毒力因子的相關(guān)性

張 略， 馬 歡

(1.沈陽市第四人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110031；2.沈陽市骨科醫(yī)院 檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110041)

尿路感染是世界上最常見的細(xì)菌性疾病之一，每年約有2.5億人患尿路感染[1]，其中導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染是最常見的醫(yī)院獲得性尿路感染之一，約有70%～80%尿路感染是由于使用導(dǎo)尿管所致[2]。導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染最重要的原因是病原微生物沿導(dǎo)管內(nèi)外表面形成生物膜，導(dǎo)尿管上生物膜群落的建立被認(rèn)為是慢性和復(fù)發(fā)性尿路感染的原因，因?yàn)樯锬と郝淠軌蚶@過宿主防御機(jī)制并耐受抗菌藥物的治療[3]。導(dǎo)尿管相關(guān)性尿路感染患者的生物膜形成與多藥耐藥均顯著高于社區(qū)獲得性尿路感染[4]，而且一旦生物膜形成會難以去除，進(jìn)而導(dǎo)致更高的膿毒癥和死亡率[5]。目前，關(guān)于尿路感染病原菌的耐藥性與生物膜和毒力因子的研究較少，已有研究僅局限于伊朗地區(qū)[6-8]。本研究對沈陽市第四人民醫(yī)院導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染患者病原菌耐藥性進(jìn)行分析，同時研究多重耐藥與生物膜表型和毒力因子的相關(guān)性，為多重耐藥菌引發(fā)尿路感染的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 選取2018年1月至2019年12月于沈陽市第四人民醫(yī)院住院期間出現(xiàn)導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染的156例患者為研究對象。導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染滿足《導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染預(yù)防與控制技術(shù)指南(試行)》[9]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，主要是指患者留置導(dǎo)尿管后，或者拔除導(dǎo)尿管48 h內(nèi)發(fā)生的泌尿系統(tǒng)感染。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 病原菌分離自研究對象的尿液培養(yǎng)標(biāo)本。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌 ATCC25922、銅綠假單胞菌 ATCC27853、糞腸球菌ATCC29212。菌株分離培養(yǎng)嚴(yán)格按照衛(wèi)生部《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 MH瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯(NB) 培養(yǎng)基(青島海博生物有限公司)，藥敏紙片(英國奧克歐德有限公司)。全自動微生物鑒定儀 (VITEK 2 Compact，法國梅里埃); CO2培養(yǎng)箱(3951,美國熱電)；鹽水分配器(Brand Dispensette，法國梅里埃)；濁度計(jì)(Plus，法國梅里埃)；移液器(89079-962，美國威達(dá)優(yōu)爾)；生物安全柜(11228 BBC 86，濟(jì)南博科)；PCR 擴(kuò)增儀(C1000 TM Thermal Cycle，美國伯樂公司)；紫外可見分光光度計(jì)(752Pro，上海棱光技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定與藥敏試驗(yàn) 采用全自動微生物分析儀和紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行菌株鑒定和藥敏試驗(yàn)，結(jié)果判讀參照CLSI 2018年標(biāo)準(zhǔn)。納入研究的抗菌藥種類包括：頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、喹諾酮類、碳青霉烯類、呋喃妥因、磷霉素。根據(jù)藥敏結(jié)果將大腸埃希菌中耐藥菌株分組:對頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、喹諾酮類、碳青霉烯類抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性大于或等于三個種類的菌株設(shè)為多重耐藥組；僅對上述四個種類抗菌藥物中的一個種類或兩個種類產(chǎn)生耐藥的菌株設(shè)為非多重耐藥組。

1.2.2 測定大腸埃希菌生物膜附著力 將大腸埃希菌中耐藥菌株接種于營養(yǎng)肉湯中37 ℃培養(yǎng)24 h，取20 μL細(xì)胞懸液加至96孔板，加入200 μL營養(yǎng)肉湯37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，生理鹽水洗滌3次除去未黏附細(xì)胞。結(jié)晶紫染料對黏附細(xì)胞染色，去除染料后，洗滌烘干，V醇∶V丙酮溶液=80∶20溶解染料，600 nm波長下讀取分光光度值A(chǔ)，設(shè)置陰性對照(A0)。根據(jù)測量結(jié)果分類：(A/A0)≤1.0無附著力；1.0<(A/A0)≤2.0弱附著力；2.0<(A/A0)≤4.0中等附著力；(A/A0)>4.0強(qiáng)附著力。

1.2.3 測定大腸埃希菌毒力因子 利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)分別檢測多重耐藥組和非多重耐藥組大腸埃希菌毒力基因。采用煮沸法提取大腸埃希菌DNA，將5 mL大腸埃希菌接種于營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)6 h，10 000 r/min離心2 min棄上清，加1 mL 生理鹽水震蕩，10 000 r/min離心5 min棄上清，于沉淀中加入100 μL蒸餾水震蕩后置于100 ℃水浴10 min，10 000 r/mim 離心5 min，上清即為擴(kuò)增模板DNA。反應(yīng)體系包括10×PCR buffer 5.0 μL、Taq酶聚合物0.5 μL、dNTP mixture 2.5 μL、上游引物和下游引物各1 μL(引物序列見表1)、ddH2O 34 μL, DNA模板2.0 μL。擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min→變性94 ℃ 30 s→退火63 ℃ 30 s→延伸72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，產(chǎn)物分析采用含0.5 μg/mL 溴乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳法，采用凝膠成像系統(tǒng)紫外線下觀察結(jié)果。觀察多重耐藥組和非多重耐藥組毒力基因表達(dá)的差異性，納入研究的毒力基因包括：第一類，黏附因子類基因：fimH、papG、sfa、afa、iha；第二類，鐵載體相關(guān)基因：feoB、fyuA、irp-2、iroN、iutA、sitA；第三類，細(xì)胞毒素相關(guān)基因：hlyD、cnf-1、sat；第四類，保護(hù)素相關(guān)基因：kspMT、neuA。

表1 毒力基因PCR擴(kuò)增引物

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，生物膜陽性率和毒力基因檢出率比較采用χ2檢驗(yàn)，生物膜附著力等級比較采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床資料統(tǒng)計(jì)

共收集導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染患者156例，具體資料見表2，其中男女比例45∶111，60歲以上患者103例(66.03%)，住院時間超過14 d患者91例(58.33%)，留置尿管超過7 d的患者98例(62.82%)，入住ICU患者100例(64.10%)以及有糖尿病病史患者121例(77.56%)。伴有危險(xiǎn)因素女性、60歲以上、入住ICU、伴有糖尿病的患者以及住院時間、留置天數(shù)較長的患者更易尿路感染。

表2 臨床資料統(tǒng)計(jì)

2.2 病原菌的種類及其分布

156份尿液培養(yǎng)標(biāo)本中分離出病原菌172株，革蘭陰性桿菌140株(81.39%)，包括大腸埃希菌(Escherichiacoli)97株(56.4%)、肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)28株(16.28%)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)6株(3.49%)、奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)6株(3.49%)，其他3株(1.74%)；革蘭陽性菌27株(15.70%)，包括腸球菌(Enterococcus)15株(8.72%)、無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)4株(2.33%)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussparophvticus)3株(1.74%)、草綠色鏈球菌(Viridansstreptococci)3株(1.74%)，其他2株(1.16%)；真菌僅有5株(2.91%)。病原菌中革蘭陰性菌占比較多，其中大腸埃希菌最常見，具體構(gòu)成見表3。

表3 病原菌的種類及分布

2.3 主要病原菌耐藥情況

對占比最多的大腸埃希菌進(jìn)行耐藥性分析，統(tǒng)計(jì)其對多種抗菌藥物的耐藥率，結(jié)果如表4所示。除氨芐西林和頭孢呋辛外，大腸埃希菌總體對抗菌藥物的耐藥率均低于60%，對磷霉素耐藥率為38.14%，呋喃妥因耐藥率30.39%，阿莫西林/克拉維酸、頭孢哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦耐藥率均低于30%，美羅培南耐藥率最低為5.15%，可以作為常規(guī)經(jīng)驗(yàn)性治療用藥。非多重耐藥組對于頭孢菌素類耐藥率超過60%，但對于β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑耐藥率低于50%，美羅培南耐藥率仍最低為11.54%，仍然可以作為嚴(yán)重感染的最后一道防線。多重耐藥組對于各類抗菌藥物的耐藥率均超過60%，成為臨床中治療的難點(diǎn)。

表4 大腸埃希菌對抗菌藥的耐藥率

2.4 大腸埃希菌多重耐藥性與生物膜表型

多重耐藥組和非多重耐藥組進(jìn)行生物膜附著力測定，結(jié)果如表5所示。大腸埃希菌生物膜實(shí)驗(yàn)陽性率為44.78%，其中多重耐藥組生物膜實(shí)驗(yàn)陽性率為80%，非多重耐藥組生物膜實(shí)驗(yàn)陽性率為34.62%。多重耐藥組與非多重耐藥組相比，生物膜陽性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.698,P<0.05)，附著力強(qiáng)度等級差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多重耐藥組更多表現(xiàn)為強(qiáng)附著力生物膜，而非多重耐藥組則更多表現(xiàn)為無附著力生物膜。

表5 大腸埃希菌生物膜的附著力等級

2.5 大腸埃希菌多重耐藥性與毒力因子

采用PCR 法檢測參與大腸埃希菌4種毒力因子(黏附素、保護(hù)素、細(xì)胞毒素、鐵載體)編碼的16種基因的表達(dá)，結(jié)果如圖1所示。多重耐藥組大腸埃希菌中，黏附素基因fimH(84.44%)和鐵載體基因feoB(84.44%)、fyuA(62.22%)、irp-2(75.56%)、iutA(68.89%)、sitA(82.22%)表達(dá)較高，均超過了60%。與非多重耐藥組相比，多重耐藥組大腸埃希菌的黏附素基因fimH、sfa、afa、iha表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.685,P<0.05； χ2=9.890,P<0.01；χ2=5.479,P<0.05；χ2=6.084,P<0.05)，與大腸埃希菌的多重耐藥密切相關(guān)。

圖1 多重耐藥組與非多重耐藥組毒力因子表達(dá)水平Fig.1 Expression levels of virulence genes in multi-drug resistance group and non-multidrug resistance groupA： 黏附素相關(guān)基因表達(dá)水平；B： 鐵載體相關(guān)基因表達(dá)水平；C： 細(xì)胞毒素相關(guān)基因表達(dá)水平；D： 保護(hù)素相關(guān)基因表達(dá)水平A： Expression levels of adhesin genes；B： Expression levels of siderophore genes；C： Expression levels of cytotoxin genes；D： Expression levels of protectin genes

3 討 論

導(dǎo)尿管尿路感染是臨床常見的問題，尤其是伴有相關(guān)危險(xiǎn)因素，如女性曾使用導(dǎo)管插入，有糖尿病基礎(chǔ)疾病等，更易引發(fā)尿路感染，同時伴隨導(dǎo)尿管插入時間、住院時間以及ICU停留時間延長，尿路感染的發(fā)病率也會更高[10-12]。本研究尿液培養(yǎng)標(biāo)本中分離出的病原菌分布與目前已知尿路感染病原菌中革蘭陰性菌占大多數(shù)，其中大腸埃希菌更常見的細(xì)菌學(xué)結(jié)果是一致的[13-14]。但是多重耐藥組和非多重耐藥組大腸埃希菌對抗菌藥物的耐藥率相差很大，其中多重耐藥組對于各類抗菌藥物耐藥率均較高且差別較小，主要與生物膜的產(chǎn)生密切相關(guān)[15-16]。生物膜是微生物菌落不可逆地結(jié)合在接觸物表面，分泌大量細(xì)胞外聚合物，包括肽聚糖、纖維蛋白和磷脂等，并將其自身包繞其中形成的膜樣物[17]。 這些包裹于生物膜內(nèi)的細(xì)菌與浮游細(xì)菌相比會表現(xiàn)出不同的活性[18]，對抗菌藥的耐藥性要高10～1 000倍[19]，而且缺乏對抗菌藥物的選擇性。這正是生物膜耐藥區(qū)別于其他類型如產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶耐藥的獨(dú)特之處，也正因?yàn)槿绱?，一些難治性尿路感染給予常規(guī)抗菌藥物治療效果較差，更換高級別抗菌藥物后仍難以治愈。

生物膜對抗菌藥物耐藥性的增加使得基于生物膜的感染在抗生素治療的情況下長期持續(xù)。形成的細(xì)菌生物膜不僅能夠幫助病菌抵御宿主的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性，而且有助于其向多重耐藥菌株方向進(jìn)化[20]。本研究中大腸埃希菌多重耐藥組生物膜實(shí)驗(yàn)陽性率顯著高于非多重耐藥組，證實(shí)了生物膜在尿路感染中的重要作用，并且其對病原菌向多重耐藥方向進(jìn)化很可能也起到一定幫助。生物膜附著力按照強(qiáng)、中、弱分為三個等級，非多重耐藥組強(qiáng)附著力占比最少，中附著力占比居中，弱附著力占比最多，這與已知生物膜附著力的研究結(jié)果是一致的[21]。但是多重耐藥組附著力各等級占比完全不同，強(qiáng)附著力占比最多，且超過50%，而且與非多重耐藥組相比，等級之間秩和檢驗(yàn)結(jié)果也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這提示生物膜附著力強(qiáng)弱與菌株發(fā)生多重耐藥存在相關(guān)機(jī)制，通過對不同生物膜附著力等級的大腸埃希菌做進(jìn)一步研究，了解生物膜的相關(guān)基因和毒力因子，從而打破生物膜耐藥機(jī)制。

大腸埃希菌在尿上皮細(xì)胞中的入侵、生長、增殖和持續(xù)存在的能力取決于其形成生物膜的能力以及利用不同毒力因子的能力[22]。黏附素家族中fimH、sfa、afa、iha基因分別編碼生成I型菌毛、S 菌毛、Dr黏附素、其他黏附因子，其編碼的黏附蛋白及侵襲蛋白可識別特異性受體對宿主進(jìn)行黏附、侵入，同時產(chǎn)生強(qiáng)生物膜，增強(qiáng)菌株對藥物的耐藥性以及對宿主免疫攻擊的抵抗力。Rosa 研究中提到fimH基因與產(chǎn)生強(qiáng)生物膜的能力密切相關(guān)[23]。Tajbakhsh等[21]研究表明，生物膜的產(chǎn)生與fimH、pap、afa和sfa毒力基因顯著相關(guān)。黏附素基因在多重耐藥組中高表達(dá)進(jìn)一步證實(shí)了病原菌多重耐藥與毒力因子參與生物膜的產(chǎn)生，幫助其形成強(qiáng)黏附力表型密切相關(guān)。雖然鐵載體相關(guān)基因在兩組之間沒有差異性，但其也參與調(diào)節(jié)生物膜的形成，且整體表達(dá)水平最高。鐵載體是鐵進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞的主要途徑，當(dāng)生物有效鐵被細(xì)菌細(xì)胞吸收后，可以直接調(diào)控多種功能代謝物的水平，如L-色氨酸、亞精胺和L-亮氨酸，直接調(diào)控生物膜形成[24]。因此，為打破多重耐藥菌難治的局限性，未來可以對黏附素和鐵載體相關(guān)基因開展深入研究，探索出多種手段抑制或破壞這些毒力基因表達(dá)，以實(shí)現(xiàn)長期有效治療多重耐藥病原菌的目標(biāo)。

綜上所述，導(dǎo)尿管相關(guān)尿路感染病原菌的多重耐藥與毒力因子參與產(chǎn)生強(qiáng)生物膜表型有關(guān)。目前針對生物膜的治療策略局限于對易形成生物膜的材料表面進(jìn)行殺菌或預(yù)防[25-27]。隨著對生物膜毒力因子研究的不斷深入，在未來會研發(fā)出對毒力因子有特異性抑制作用的新型藥物。