山羊溶血性曼氏桿菌病的診斷

文│蔣小剛（廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所） 吳翠蘭 彭昊 李軍（廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

溶血性曼氏桿菌為變形菌門、γ-變形菌綱、巴氏桿菌目、巴氏桿菌科、曼氏桿菌屬的成員，是一種革蘭氏陰性短桿菌的條件性致病菌，通常寄居在動(dòng)物上呼吸道中。溶血性曼氏桿菌能感染山羊、綿羊、牛、鹿、狗、貓、鱷魚等多種動(dòng)物。羊感染溶血性曼氏桿菌通常引起肺炎、新生羔羊急性敗血癥，給養(yǎng)殖行業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。2022年3月，廣西某羊場(chǎng)發(fā)生一起溶血性曼氏桿菌病的病例，現(xiàn)將診斷結(jié)果報(bào)道如下。

一、臨床癥狀和病理變化

廣西某羊場(chǎng)存欄山羊約100頭，已按照既定免疫程序免疫口蹄疫滅活疫苗、小反芻獸疫弱毒疫苗和三聯(lián)四防疫苗，定期在飼料中添加驅(qū)寄生蟲藥。2022年3月，該養(yǎng)殖場(chǎng)從外縣購(gòu)買30頭羊，購(gòu)買10天后，部分羊只開始出現(xiàn)精神沉郁、采食減少，隨后表現(xiàn)為咳嗽、流鼻涕、發(fā)燒、呼吸困難等癥狀，發(fā)病率為36.7%（11/30）。對(duì)病死山羊進(jìn)行剖檢，剖檢發(fā)現(xiàn)肺臟有出血，胸腔和腹腔有積液，肝、脾無(wú)明顯變化。

二、病料采集

無(wú)菌采集病死山羊的肺、胸腔積液及腹腔積液。

三、病原檢測(cè)

1.細(xì)菌分離。用接種環(huán)挑取采集的肺、胸腔積液、腹腔積液，在血瓊脂平板、胰蛋白胨大豆瓊脂平板上進(jìn)行接種，37℃培養(yǎng)24小時(shí)后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，然后再挑取純化后的菌落進(jìn)行革蘭氏染色、光學(xué)顯微鏡下鏡檢。細(xì)菌分離結(jié)果顯示，胰蛋白胨大豆瓊脂平板上出現(xiàn)光滑、圓潤(rùn)的細(xì)小菌落，而血平板上出現(xiàn)β溶血的細(xì)小菌落，鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌。

2.支原體分離。將采集的肺和積液充分研磨，混勻后取上清，一部分置于-20℃?zhèn)溆?，一部分?.45微米濾器過(guò)濾。再將濾液加入到支原體培養(yǎng)基上放置于含有5% CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4～5天。連續(xù)傳2代后，再用接種環(huán)劃線接種于支原體固體培養(yǎng)基上，放置于含有5%CO2的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4～5天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。結(jié)果顯示，支原體液體培養(yǎng)基無(wú)明顯變色，固體培養(yǎng)基上也未有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明無(wú)支原體生長(zhǎng)。

3.分離菌生化鑒定。采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)分離菌株進(jìn)行生化指標(biāo)測(cè)定，將純化的菌落接種于葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖、麥芽糖、山梨糖、海藻糖、甘露糖和脲酶的生化鑒定管中，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，觀察細(xì)菌生化特性。生化試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌能發(fā)酵葡萄糖、氧化酶、甘露醇、山梨醇、木糖和麥芽糖；而山梨糖、海藻糖、甘露糖和脲酶為陰性反應(yīng)。此結(jié)果與陸承平《獸醫(yī)微生物學(xué)》（第三版）的溶血性曼氏桿菌的特性相符合，初步判斷該分離株為溶血性曼氏桿菌。

4.PCR檢測(cè)。

（1）反應(yīng)模板制備。以上述組織上清液和分離菌為樣本，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取組織上清和分離菌的DNA，然后-20℃保存，備用。

（2）PCR引物。參考吳翠蘭等文獻(xiàn)合成綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、多殺巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

（3）PCR鑒定。分別以上述組織上清液和分離菌的DNA為模板，以綿羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、多殺巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌特異性引物為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性5分鐘；然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)95℃變性30秒、49～53℃退火40秒、72℃延伸30秒；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增結(jié)束后，取7微升PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果。

（4）電泳結(jié)果。電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組織上清液模板和分離菌的DNA模板均擴(kuò)出溶血性曼氏桿菌目的條帶，表明該病原為溶血性曼氏桿菌，該結(jié)果與前述生化鑒定結(jié)果相符合。而羊肺炎支原體、絲狀支原體山羊亞種、多殺巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌特異性引物均未擴(kuò)出相應(yīng)條帶。

5.動(dòng)物致病性試驗(yàn)。將10只健康的昆明鼠隨機(jī)分成1個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，試驗(yàn)組每只小鼠腹腔注射分離菌（1×109CFU/毫升）0.3毫升，另一組每只小鼠則注射同等劑量的生理鹽水作為對(duì)照組，觀察小鼠的身體狀況，記錄結(jié)果。試驗(yàn)組小鼠在注射后6小時(shí)開始出現(xiàn)行動(dòng)緩慢、精神沉郁，在24小時(shí)內(nèi)已有60%（3/5）的小鼠出現(xiàn)死亡。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖解，發(fā)現(xiàn)肺腫脹、充血。從小鼠肺中回收分離到的細(xì)菌。

6.藥物敏感性試驗(yàn)。取100微升純培養(yǎng)的細(xì)菌均勻涂在胰蛋白胨大豆瓊脂平板上，然后用無(wú)菌鑷子分別夾取23種藥敏紙片貼在平板上，置于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，測(cè)量各種藥敏紙片的抑菌圈直徑并判斷藥敏結(jié)果。結(jié)果顯示，該分離菌對(duì)羅紅霉素、頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢他啶、卡那霉素、壯觀霉素等6種藥物敏感；對(duì)頭孢曲松、利福平、青霉素、四環(huán)素、林可霉素、恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、復(fù)方新諾明等17種藥物耐藥，藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

四、診治結(jié)論

根據(jù)臨床癥狀、病理變化、細(xì)菌分離培養(yǎng)、支原體分離、分離株生化鑒定、PCR檢測(cè)、動(dòng)物致病性試驗(yàn)等，確定該起病例是由溶血性曼氏桿菌引起的。

關(guān)于該病的治療，首先對(duì)病羊進(jìn)行隔離，對(duì)污染的羊圈和場(chǎng)地進(jìn)行消毒處理。其次，采用敏感藥物卡那霉素和頭孢噻肟進(jìn)行治療。再次，加強(qiáng)飼養(yǎng)衛(wèi)生管理，消除各種誘發(fā)因素，防止寄生蟲侵襲，增強(qiáng)體質(zhì)。經(jīng)過(guò)治療后羊只病情逐漸好轉(zhuǎn)。

五、預(yù)防措施

羊病預(yù)防措施主要包括提高羊只抗病能力、做好環(huán)境衛(wèi)生和消毒、疫苗接種、藥物預(yù)防和定期驅(qū)蟲。

1.提高羊只抗病能力。及時(shí)補(bǔ)飼，特別是正在發(fā)育的幼齡羊、懷孕和哺乳期的成年母羊進(jìn)行合理補(bǔ)飼尤為重要。堅(jiān)持自繁自養(yǎng)和嚴(yán)進(jìn)嚴(yán)出的原則，不僅減少入場(chǎng)檢疫的工作量，還可有效避免因羊只引入而帶入新的傳染源。羊只只能從非疫區(qū)購(gòu)入，經(jīng)當(dāng)?shù)孬F醫(yī)部門檢疫并簽發(fā)檢疫合格證明。到達(dá)該場(chǎng)后再經(jīng)本場(chǎng)所在地的獸醫(yī)檢疫，隔離觀察42天，確認(rèn)為健康者，經(jīng)藥浴、驅(qū)蟲、消毒方可與原有羊群混養(yǎng)。

2.搞好環(huán)境衛(wèi)生和消毒。凈化養(yǎng)殖場(chǎng)周邊環(huán)境，減少病原微生物的滋生和疫病傳播，對(duì)羊圈、活動(dòng)場(chǎng)地及用具要經(jīng)常清掃，保持潔凈、干燥。及時(shí)清除糞便和污物，堆積發(fā)酵。飼草飼料要盡量保持新鮮、清潔和干燥，防止發(fā)霉變質(zhì)。羊場(chǎng)要建立切實(shí)可行的消毒制度，定期對(duì)羊舍、用具、地面土壤、糞便、污水、皮毛等進(jìn)行消毒。

3.傳染病的預(yù)防接種。疫苗接種能激發(fā)羊只產(chǎn)生抗體，使其對(duì)該種疫病由敏感轉(zhuǎn)為不敏感。羊場(chǎng)應(yīng)根據(jù)自身制定合理的免疫程序。

4.藥物預(yù)防和定期驅(qū)蟲。藥物預(yù)防是指定期將適量藥物拌入飼料中，或溶解在飲水中進(jìn)行群體藥物預(yù)防。但長(zhǎng)期使用藥物預(yù)防容易產(chǎn)生耐藥菌株，影響藥物的預(yù)防效果，因此，要經(jīng)常進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇有高度敏感性的藥物用于防治，最好是將幾種藥物交替使用，這樣可以延緩耐藥性菌株的產(chǎn)生速度。此外羊體內(nèi)或體表會(huì)存在一些寄生蟲，因此，還要定期驅(qū)蟲。

六、討論

溶血性曼氏桿菌是引起山羊呼吸道疾病的重要病原之一，其致病率較高，發(fā)病率達(dá)50%左右。溶血性曼氏桿菌病的發(fā)生往往是由于氣候變化、長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素引起的，還可能是支原體等病原入侵機(jī)體而引起的繼發(fā)感染。該研究從調(diào)運(yùn)的山羊中分離出1株具有致病性的溶血性曼氏桿菌，進(jìn)一步證實(shí)山羊受應(yīng)激時(shí)容易引起溶血性曼氏桿菌病。

在動(dòng)物致病性試驗(yàn)中，小白鼠在攻毒分離菌6小時(shí)后開始出現(xiàn)行動(dòng)緩慢、精神沉郁的情況，在24小時(shí)內(nèi)已有60%的小鼠出現(xiàn)死亡。剖解死亡小鼠發(fā)現(xiàn)肺腫脹、充血，同時(shí)，從小鼠肺中分離到該菌。說(shuō)明該分離株具有很強(qiáng)的致病性。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，溶血性曼氏桿菌的致病性與血清分型及毒力因子息息有關(guān)。目前溶血性曼氏桿菌共有12種血清型，分別為A1、A2、A5、A6、A7、A8、A9、A12、A13、A14、A16和A17，其中流行最廣的血清型是A1、A2、A6，其次為A7、A9、A11和A12。在相關(guān)報(bào)道中，羊溶血性曼氏桿菌的優(yōu)勢(shì)血清為A1和A2，F(xiàn)odor等對(duì)匈牙利山羊溶血性曼氏桿菌進(jìn)行血清型分析，發(fā)現(xiàn)A2血清型占比為94%；郝敏等對(duì)四川省某羊場(chǎng)分離到的19株綿羊源溶血性曼氏桿菌進(jìn)行血清型分型，結(jié)果顯示，7株為A1型，11株為A2型；江金歡等對(duì)西藏地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的1株綿羊源溶血性曼氏桿菌進(jìn)行血清型分型，結(jié)果顯示，該分離株為A2型；Abay等對(duì)山羊源溶血性曼氏桿菌進(jìn)行血清型分型，發(fā)現(xiàn)A1血清型占比最高，為43.5%，其次為A2和A7；王晨驍?shù)劝l(fā)現(xiàn)陜西某奶山羊養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的溶血性曼氏桿菌為A2型。而本次分離菌株屬于哪一種血清型還有待進(jìn)一步確定。溶血性曼氏桿菌的毒力因子較多，如白細(xì)胞毒素、脂多糖、外膜蛋白、莢膜、黏附素等。白細(xì)胞毒素主要作用于反芻動(dòng)物白細(xì)胞，引起白細(xì)胞的凋亡和壞死，還可引起溶血和血小板集聚。而本研究分離到的菌株有溶血現(xiàn)象，推測(cè)該分離株可能含有白細(xì)胞毒素。

本研究采用臨床上比較常用的23種藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，該分離菌對(duì)羅紅霉素、頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢他啶、卡那霉素、壯觀霉素等6種藥物敏感；對(duì)頭孢曲松、利福平、青霉素、四環(huán)素、林可霉素、恩諾沙星等17種藥物耐藥。由此可見，該菌株耐藥性較為嚴(yán)重。試驗(yàn)結(jié)果前人報(bào)道的不太一致，說(shuō)明不同地區(qū)、不同物種分離到的菌株其耐藥性存在差異，這可能與不同地區(qū)的免疫程序和用藥情況不同有關(guān)。因此，通過(guò)藥敏試驗(yàn)可以篩選出敏感性藥物，進(jìn)而對(duì)溶血性曼氏桿菌病進(jìn)行預(yù)防與治療，避免該類疾病的過(guò)度傳染，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。

七、結(jié)語(yǔ)

本試驗(yàn)從調(diào)運(yùn)過(guò)程中發(fā)病的山羊體內(nèi)分離出革蘭氏陰性短桿菌，經(jīng)過(guò)鑒定為溶血性曼氏桿菌，并對(duì)小白鼠具有致死性。經(jīng)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該分離株對(duì)多種藥物耐藥，只對(duì)少量藥物敏感，研究結(jié)果對(duì)該場(chǎng)治療山羊感染的溶血性曼氏桿菌用藥提供了參考。