沙庫巴曲纈沙坦鈉片通過NF2/Mst1信號通路抑制細(xì)胞凋亡改善心肌梗死大鼠心肌纖維化

向長鐵 劉佳麗 張愛民 吳倩 聶連桂 劉茂軍 楊軍

(1南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科，湖南 衡陽 421001；2常德市石門縣人民醫(yī)院)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病是導(dǎo)致人類疾病死亡的主要原因之一，據(jù)推算我國現(xiàn)有冠心病患者1 100萬〔1〕。而心肌梗死為導(dǎo)致死亡及不良預(yù)后的最常見的原因，尤其心肌梗死后往往出現(xiàn)明顯的心功能不全，故嚴(yán)重影響了心肌梗死的長期預(yù)后，而心肌重構(gòu)是其發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。心肌梗死后心肌細(xì)胞可出現(xiàn)細(xì)胞凋亡、壞死，正常心肌細(xì)胞數(shù)量減少，間質(zhì)膠原纖維增多，導(dǎo)致心肌負(fù)性重構(gòu)?，F(xiàn)有研究表明細(xì)胞凋亡是心肌梗死后心肌重構(gòu)的重要機制〔2〕。而神經(jīng)纖維蛋白(NF)2/哺乳動物不育系20樣激酶(Mst)1信號通路在多項研究中已被證實可以促進心肌細(xì)胞凋亡〔3～6〕，Dalal等〔4〕研究顯示，在心肌梗死大鼠模型中，異丙腎上腺素(Iso)可翻譯修飾NF2激活Hippo信號通路通過線粒體死亡途徑參與心肌細(xì)胞凋亡，相反NF2/Mst1活化受阻，則抑制細(xì)胞凋亡。 沙庫巴曲纈沙坦鈉片(諾欣妥，Lcz696)是由腦啡肽酶抑制劑沙庫巴曲和血管緊張素受體抑制劑纈沙坦(Vdt)組成一種抗心力衰竭藥物，目前已有多項研究證明，諾欣妥具有心血管保護和抗心肌重構(gòu)作用〔7～9〕。研究證實，Lcz696可以通過抑制促炎性細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9及醛固酮的生成等在心肌梗死中發(fā)揮心肌保護作用〔9〕。但其否通過MF2/Mst1信號通路抑制細(xì)胞凋亡保改善梗死后心肌纖維化目前尚不清楚。本實驗通過建立異丙腎上腺素致大鼠心肌梗死模型，研究Lcz696能否通過NF2/Mst1信號通路抑制細(xì)胞凋亡改善心肌梗死后心肌纖維化。

1 材料與方法

1.1材料 40只雄性SD大鼠，體重(220±20)g，于南華大學(xué)動物實驗中心處購買，保證水源和食物充足，在室溫(23±1)℃下分籠喂養(yǎng)，晝夜更替為12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w。

1.2主要試驗試劑 Iso(大連美侖公司)；Lcz696(瑞士Novartis Pharma Schweiz AG公司)；Vdt(海南皇隆制藥股份有限公司)；NF2、Mst1等一抗(美國Proteinch公司)；一抗甘油醛-3磷酸脫氫酶(GAPDH，晶欣生物公司)；羊抗兔二抗(武漢博士德公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒及細(xì)胞裂解液(碧云天公司)。

1.3動物模型的建立及分組 大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，隨機分成4組，對照組(Control組)、模型組(Iso組)、Lcz696干預(yù)組(Iso+Lcz696組)和Vdt干預(yù)組(Iso+Vdt組)，后3組經(jīng)腹腔注射Iso〔50 mg/(kg·d)〕共2次，Control組同時腹腔注射等量生理鹽水2次，通過檢測心電圖和肌鈣蛋白確定模型建立成功，然后Iso+Lcz696組每日分別予以Lcz696(60 mg/kg)灌胃，Iso+Vdt組每日分別予以Vdt(30 mg/kg)灌胃，Control組和Iso組每日分別予以等量的蒸餾水灌胃。共干預(yù)4 w。

1.4Masson染色觀察各組心肌膠原沉積 取出甲醛浸泡的心臟組織，過氧化氫沖洗，乙醇脫水，石蠟包埋后，再使用刀片切取4 μm左右組織，脫蠟直至水化，再使用蘇木素染色8～10 min，沖洗，再通過1%鹽酸-酒精分色，沖洗，接著采用麗春紅酸性品紅液染色5～10 min，沖洗，予1%磷鉬酸水溶液處理5 min后再經(jīng)苯胺藍(lán)液染色5 min，然后置于1%冰醋酸中浸泡1 min，最后再次予以梯度酒精脫水，透明，置于光鏡下觀察。

1.5Western印跡檢測相關(guān)蛋白表達(dá) 取各組大鼠左心室組織樣本，研磨均勻后加入細(xì)胞裂解液和苯甲基磺酰氟(PMSF)溶液后裂解10 min，離心提取上清液，通過BCA比色法進行蛋白定量，然后再通過制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，用稀釋好的GAPDH、NF2、Mst1、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、半胱天冬酶(Caspase)9的一抗在4℃下孵育24 h，TBST溶液漂洗3次后，再用稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗在37℃下孵育1 h，TBST漂洗3次，避光下在裝有BIO-ID的顯影儀器上顯影，經(jīng)圖像分析后，獲取目的條帶，通過與GAPDH的灰度對比來表示蛋白表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠存活情況 干預(yù)結(jié)束后存活大鼠36只，Control組10只，Iso組9只，Iso+Lcz696組9只，Iso+Vdt組8只。大鼠死亡原因與心肌梗死后心肌損傷或心力衰竭有關(guān)。

2.2各組大鼠心電圖分析 建模后檢測各組大鼠心電圖變化，Iso組、Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組大鼠建模成功后心電圖對比Control組，Ⅱ?qū)?lián)T波高聳，ST段呈弓背向上抬高。見圖1。

2.3各組大鼠血漿肌鈣蛋白檢測 建模后檢測抽取的尾部靜脈血，檢測各組大鼠肌鈣蛋白值變化，Control組、Iso組、Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組大鼠血漿肌鈣蛋白水平分別為：(30.17±6.99)pg/ml、(376.12±49.72)pg/ml、(385.22±61.99)pg/ml、(383.54±41.36)pg/ml，Iso組、Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組血漿肌鈣蛋白水平與Control組相比均有明顯升高(P<0.05)。

2.4各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果 Masson染色觀察心肌組織膠原沉積，沉積膠原纖維為藍(lán)染。與Control組相比，Iso組藍(lán)色區(qū)域明顯增多，膠原纖維沉積明顯。與Iso組相比，Iso+Lcz696組藍(lán)色區(qū)域顯著減少，膠原纖維沉積顯著減少。而Iso+Lcz696組與Iso+Vdt組相比，心肌膠原纖維沉積顯著減少。見表1、圖2。

圖1 各組大鼠心電圖結(jié)果

表1 各組膠原纖維占比及Caspase9、Bcl-2、NF2、Mst1蛋白表達(dá)水平比較

圖2 各組心肌組織Masson染色(×400)

2.5各組心肌組織Caspase9、Bcl-2、NF2和Mst1等蛋白表達(dá) 與Control組相比，Iso組心肌組織中Caspase9蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。與Iso組相比，Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組大鼠心肌組織中Caspase9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，而Iso+Lcz696組Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，Iso+Vdt組Bcl-2表達(dá)則上調(diào)不明顯(P>0.05)。同時與Control組相比，Iso組心肌組織中NF2、Mst1的蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)。與Iso組相比，Iso+Lcz696組和Iso+Vdt組NF2、Mst1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，但I(xiàn)so+Lcz696組與Iso+Vdt組相比NF2、Mst1的蛋白下調(diào)更明顯(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組大鼠心肌組織Caspase9、Bcl-2、NF2、Mst1蛋白表達(dá)結(jié)果比較

3 討 論

心肌梗死后出現(xiàn)的心肌重構(gòu)是決定患者長期預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)〔10〕，而心肌細(xì)胞凋亡則是其中的重要病理機制〔11〕。本實驗通過以腹腔注射Iso 2 d建立大鼠心肌梗死模型〔12～14〕。建模后對照組及干預(yù)組心電圖T波高聳，ST段成弓背上抬，肌鈣蛋白較正常組明顯升高。確定模型建立成功。同時Masson染色顯示心肌梗死大鼠存在明顯心肌纖維化，Iso組大鼠心肌組織Caspase9明顯上調(diào)，而Bcl-2的表達(dá)下調(diào)，提示心肌梗死后心肌重構(gòu)可能與心肌細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。

NF2是埃茲蛋白/根蛋白/膜突蛋白(ezrin/radixin/moesin，ERM)家族的成員，一種促凋亡激酶，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞胞內(nèi)和胞外信號傳遞。Mst1是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在心肌損傷中易被激活〔5〕。NF2/Mst1信號通路在心肌細(xì)胞更新和心臟修復(fù)作用中起著重要作用〔4〕。有研究表明，在心肌缺血再灌注損傷模型中，NF2激活磷酸化后，可激活Mst1，促進心肌細(xì)胞凋亡〔15〕。另有研究顯示，Iso可誘導(dǎo)NF2/Mst1的表達(dá)增加，NF2/Mst1的失活可增加心肌梗死后心肌細(xì)胞數(shù)量，減少瘢痕形成，改善心功能，而NF2/Mst1上調(diào)可通過線粒體死亡途徑，促進心肌細(xì)胞凋亡〔4〕。本研究提示，NF2/Mst1激活誘發(fā)的細(xì)胞凋亡可能參與心肌梗死后心肌重構(gòu)發(fā)生機制。

諾欣妥是近年來在心力衰竭治療領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的新藥，已有研究顯示Lcz969可通過抑制鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白改善心臟重構(gòu)〔4〕。另有研究顯示，Lcz696通過降低糖尿病小鼠心肌纖維化改善心臟功能，可能與沙庫巴曲的作用有關(guān)〔16～20〕。Lcz696可以減輕心肌梗死后心肌纖維化，原因可能是由沙庫巴曲和Vdt共同作用所致〔5〕。本研究提示Lcz696可能通過NF2/Mst1信號通路通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來改善心肌梗死后大鼠心肌纖維化；Lcz696改善心肌重構(gòu)的作用可能沙庫巴曲和Vdt共同作用所致，其抑制心肌梗死后心肌纖維化的作用可能與抑制NF2/Mst1介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。以上研究為進一步探討梗死后心肌重構(gòu)發(fā)生機制及干預(yù)策略提供了初步的實驗依據(jù)。