翠竹鞭芽組培快繁高效再生技術(shù)體系的構(gòu)建1)

鄭毅 鄭笑 林樹燕 姚文靜 徐薪璐 周必鐃 卞麗麗

(南京林業(yè)大學，南京，210037)

翠竹(Pleioblastuspygmaeus(Miq.) E. G. Camus)為竹亞科大明竹屬植物，植株矮小，耐陰，葉片翠綠，且極耐修剪，是一種十分優(yōu)良的地被類觀賞植物。尤其近年來，地被類竹種以及彩葉竹種在園林綠化中的應(yīng)用愈來愈廣泛，其經(jīng)濟價值近年來也逐漸飆高[1-2]。但受到繁殖材料的獲得困難及繁殖方法的限制，傳統(tǒng)的繁育方式已無法滿足翠竹日益增大的市場需求，且園林用竹對植物的遺傳構(gòu)成一致性和植株大小的一致性要求較高；所以構(gòu)建高效的翠竹組培快繁再生體系勢在必行。

關(guān)于竹子的組織培養(yǎng)已取得了一些進展。自1982年起，國外相繼報道了印度箣竹、勃氏甜龍竹等數(shù)十個竹種的組織培養(yǎng)技術(shù)研究情況[3]。我國對竹子組織培養(yǎng)技術(shù)研究起步較晚，但經(jīng)幾代科研工作者的不懈努力，目前麻竹[4-5]、甜龍竹[6]、巨龍竹[7]等重要經(jīng)濟竹種的組培快繁技術(shù)，在生產(chǎn)中的應(yīng)用已經(jīng)十分成熟。但實際生產(chǎn)中，利用試管快繁技術(shù)進行批量繁殖的園林觀賞用竹并不多。由于竹類植物的花和種子不易穩(wěn)定地獲得，且除種胚外其余外植體類型都很難通過誘導愈傷分化獲得再生植株[8]，所以以單芽為外植體，誘導產(chǎn)生芽叢，經(jīng)誘導生根后移至土壤，這種不經(jīng)過脫分化過程直接獲得大量完整植株的繁殖方式應(yīng)用更為廣泛。

鞭芽是竹子出筍成竹、長鞭形成地下根系結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)。本研究以翠竹的鞭芽為試驗材料，嘗試構(gòu)建翠竹組織培養(yǎng)快繁高效再生技術(shù)體系，為翠竹工廠化大規(guī)模生產(chǎn)和其園林應(yīng)用推廣提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2015年5月20日，將采于江蘇省南京市南京林業(yè)大學白馬基地竹種園(118°22′～119°14′E，31°14′～32°37′N)的翠竹(Pleioblastuspygmaeus(Miq.) E. G. Camus)種子播于花盆(上口內(nèi)徑26 cm、內(nèi)高22 cm、盆底內(nèi)徑18 cm)中，培養(yǎng)基質(zhì)選擇體積比為V(泥炭)∶V(黃棕壤)∶V(珍珠巖)=12∶12∶1的混合基質(zhì)；定期進行觀察。2019年，將翠竹實生苗包括鞭根系統(tǒng)及基質(zhì)整體取出，洗去泥土，選取翠竹竹鞭上帶有未萌動和剛萌動鞭芽的鞭段(約1.5 cm)作為外植體。

1.2 外植體的消毒及啟動培養(yǎng)

2019年5月，將盆栽實生苗取出，清水處理后，把竹鞭切分成1.5 cm長的帶芽鞭段，用洗潔精清洗后，用自來水不間斷沖洗24 h。隨后在超凈工作臺上進行消毒處理，選取體積分數(shù)為70%的酒精、體積分數(shù)為2.5%的NaClO溶液兩種消毒劑進行消毒。先用無菌水將鞭段沖洗3遍，之后在體積分數(shù)為70%的酒精中分別消毒處理30、60、90 s；用無菌水沖洗5遍后，再用體積分數(shù)為2.5%的NaClO溶液分別處理10、15、20 min。兩種消毒劑各設(shè)3個處理水平，共9個處理組合，每個組合接種50瓶；處理時上下?lián)u動，最后再用無菌水沖洗5遍，完成外植體的消毒。

本研究選擇MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中蔗糖質(zhì)量濃度控制在30 g·L-1，pH控制在5.75～5.85之間。將消毒完畢的鞭芽，接種到誘導培養(yǎng)基“MS培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1的噻苯隆(TDZ)+質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的萘乙酸(NAA)”上，每瓶1個；之后，將培養(yǎng)瓶置于無菌培養(yǎng)室中培養(yǎng)觀察，每天12～14 h的光照，光照強度1 200～1 500 lx，培養(yǎng)室溫度控制在25 ℃，試驗重復3次；20 d后統(tǒng)計污染率及誘導成活率，污染率=(污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù))×100%、成活率=(萌芽外植體數(shù)/接種后無菌莖段總數(shù))×100%。

1.3 無菌翠竹鞭芽增殖培養(yǎng)

以鞭芽為外植體的瓶苗需要經(jīng)增殖培養(yǎng)基的處理才能產(chǎn)生芽叢，待瓶苗誘導培養(yǎng)20 d，取成活且無菌的組培苗，將其接種在增殖培養(yǎng)基上。增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基仍選用MS培養(yǎng)基，生長調(diào)節(jié)劑則選用6-芐氨基腺嘌呤(6-BA，質(zhì)量濃度為3、4、5 mg·L-1)與萘乙酸(質(zhì)量濃度為0.05、0.30、0.50 mg·L-1)，共9種處理，每個處理接種30瓶，每瓶接種1個無菌芽段。培養(yǎng)30 d觀察增殖情況，統(tǒng)計每瓶內(nèi)的叢芽增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=擴繁后的芽數(shù)/轉(zhuǎn)入的芽數(shù)。

1.4 翠竹叢芽的生根培養(yǎng)

將增殖后的芽苗繼代培養(yǎng)3～5次，待叢芽增殖到20～30個時，將叢芽接種到生根培養(yǎng)基上。生根培養(yǎng)基選用0.5倍MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，以6-芐氨基腺嘌呤(質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0 mg·L-1)、萘乙酸(質(zhì)量濃度為1.0、1.5 mg·L-1)、吲哚丁酸(IBA，質(zhì)量濃度為0.5、1.0 mg·L-1)3種生長調(diào)節(jié)劑設(shè)置12個處理組合，每個組合接種30瓶。40 d后觀察統(tǒng)計生根數(shù)、根長并計算生根率，生根率=(生根叢苗數(shù)/接入的總苗數(shù))×100%。

1.5 翠竹瓶苗煉苗移栽

生根后，對翠竹瓶苗進行煉苗移栽。為保持瓶內(nèi)濕度，塑料袋罩住去蓋的培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶揭蓋置于培養(yǎng)室中煉苗15 d；取出組培苗，洗去培養(yǎng)基，移栽至基質(zhì)中，定期澆水。設(shè)置3種培養(yǎng)基質(zhì)，基質(zhì)體積比分別為V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1、V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1、V(壤土)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1，每種基質(zhì)栽種50株組培苗，觀察植株生長情況并統(tǒng)計移栽成活率。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS22.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析及多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒方案對污染率及成活率的影響

在洗潔精清洗、流水沖洗的基礎(chǔ)上，本研究選用了體積分數(shù)為70%的酒精與體積分數(shù)為2.5%的NaClO溶液兩種消毒劑搭配使用。

試驗結(jié)果表明(見表1)：處理1的污染率最高，為94.00%；處理8、處理9的污染率最低，為4.67%、6.67%；說明體積分數(shù)為70%的酒精與體積分數(shù)為2.5%的NaClO溶液的消毒劑組合，可以有效地殺死大部分微生物，且隨著處理時間的增長，污染率逐步降低。從外植體成活率看，對于酒精處理而言，處理90 s的平均成活率最低(為47.50%)，處理60 s的平均成活率最高(高達87.05%)；對于NaClO處理而言，處理20 min的平均成活率最低(為57.30%)，處理15 min的平均成活率最高(為69.15%)。這說明，雖然長時間處理的殺菌效果更好，但過長的消毒時間會導致芽段成活率較低，這與本研究的消毒目的相悖。這是由于鞭芽的芽組織十分幼嫩，酒精的過長時間處理影響了其生長活性，消滅微生物的同時也殺死了外植體材料。

表1 不同消毒方案的啟動培養(yǎng)污染率及成活率

綜合污染率、成活率兩項指標看，最佳消毒方案為“體積分數(shù)為70%的酒精處理60 s+體積分數(shù)為2.5%的NaClO溶液處理15 min”，這樣的組合，既有著不錯的滅菌效果，且不會對芽的活性造成影響，有著較好的成活表現(xiàn)。

2.2 萘乙酸與6-芐氨基腺嘌呤對叢芽繼代增殖的影響

不同組合的植物生長調(diào)節(jié)劑處理對芽叢增殖的效果不同(見表2)。由表2可見：對于6-芐氨基腺嘌呤而言，隨著其質(zhì)量濃度從3 mg·L-1提高到5 mg·L-1，增殖系數(shù)也從2.99提高到了5.91，芽叢長勢也在逐漸提高。對萘乙酸而言，質(zhì)量濃度為0.05 mg·L-1時，增殖系數(shù)最小，增殖效果也較差；質(zhì)量濃度為0.30 mg·L-1時，增殖系數(shù)最高，芽叢增殖效果最好；質(zhì)量濃度為0.50 mg·L-1時，芽段仍正常生長，芽叢長勢也較好，但新生苗叢芽較少，增殖系數(shù)也相對較低?？梢姡S著細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤的質(zhì)量濃度提高，芽叢的增殖效果越來越佳，6-芐氨基腺嘌呤質(zhì)量濃度為5 mg·L-1時，增殖效果最好。而培養(yǎng)基中生長素萘乙酸的質(zhì)量濃度過低時，芽叢的生長狀況不佳，增殖效果也較差，隨著萘乙酸質(zhì)量濃度的提高，芽叢的長勢逐漸變好，增殖系數(shù)也隨之提高，但隨著萘乙酸質(zhì)量濃度的繼續(xù)升高，芽苗高度越長越高，新生叢苗卻沒有隨之增多。結(jié)果表明，當6-芐氨基腺嘌呤質(zhì)量濃度為5 mg·L-1、萘乙酸質(zhì)量濃度為0.3 mg·L-1時，翠竹芽段的增殖系數(shù)最高(為7.24)、新生芽叢數(shù)最多，且長勢健壯、葉片寬大、顏色翠綠，增殖效果最好。

表2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比時翠竹芽段的增殖狀況

經(jīng)鄧肯(Duncan)多重比較，不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理組合對芽段增殖系數(shù)的影響，不同處理組合之間表現(xiàn)不同：處理8為最高組；處理9低于處理8，而顯著高于其他組，為次高組；處理1顯著低于其他組，為最低組。說明不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對翠竹增殖的影響差異顯著，處理8效果最好，處理1效果最差。綜合效果，翠竹芽段最佳增殖培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為5 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質(zhì)量濃度為0.30 mg·L-1的萘乙酸”。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對翠竹生根的影響

在叢苗多次繼代后進行生根誘導，生根培養(yǎng)培養(yǎng)基選用0.5倍MS培養(yǎng)基，設(shè)置12個不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合(見表3)，不同處理間生根率差異較大，處理4、處理6、處理11誘導生根效果較好，生根率分別達到了100%、85%、90%。

表3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比處理的翠竹芽段生根率

2.3.1 翠竹生根誘導過程中的形態(tài)觀察

以處理4為例，培養(yǎng)7 d時，開始有根出現(xiàn)(見圖1a)；培養(yǎng)14 d時，根持續(xù)伸長，根數(shù)逐漸增多(見圖1b)；培養(yǎng)35 d時，植株的根系已十分繁盛(見圖1c)，生根數(shù)逐漸穩(wěn)定，增長速度放緩；培養(yǎng)42 d時，植株的根繼續(xù)伸長(見圖1d)；培養(yǎng)49 d時，根系都已達到煉苗栽種要求(見圖1e、f)。

2.3.2不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對翠竹生根數(shù)量的影響

以生根率較高的3個處理(處理4、處理6、處理11)為研究對象，對這3個處理中瓶苗的根，按生長長度(L)進行分級，具體分成010 cm的4個級別，分別統(tǒng)計每級內(nèi)的根數(shù)及總根數(shù)，并計算每個時期的平均根長。每隔1周進行1次統(tǒng)計，共統(tǒng)計7次。

a為培養(yǎng)7 d時，翠竹組培苗不定根出現(xiàn)；b為培養(yǎng)14 d時，根進一步伸長；c為培養(yǎng)35 d時，根系逐漸增多；d為培養(yǎng)42 d時，根系繼續(xù)伸長；e、f為培養(yǎng)49 d時，根系已經(jīng)非常繁茂。

統(tǒng)計其平均生根數(shù)隨時間的變化規(guī)律(見圖2)。由圖2可見：處理4生根最早，在0～7 d階段已誘導出根，隨后不斷有新根產(chǎn)生；且在7～14 d階段內(nèi)根數(shù)增長速度較快，增幅較大；培養(yǎng)21 d后，其增長趨勢逐漸平緩，每個階段的增幅也較小。處理6生根最晚，在28～35 d階段才有根生出，此階段根數(shù)增長速度同樣最快，7 d內(nèi)有約30條新根產(chǎn)生。處理11生根也較晚，在21～28 d時才有根產(chǎn)生，此階段也同樣是處理11生根數(shù)增長速度最快的時期；在此之后，雖然其根數(shù)增長速度有所放緩，但每階段都能保持5條以上的增幅；在49 d時，處理11的平均生根數(shù)為50.5條，超過了處理4的48.83條。綜上所述，從誘導生根的速度看，處理4最早誘導出根，處理6、處理11則出根較晚。從誘導出根后根數(shù)的增長速度看，處理4在誘導出根后，經(jīng)42 d根數(shù)才增長至46條左右，增長速度較為平緩；而處理11在出根后，僅用21 d根數(shù)便增長至相同水平，增長速度極快；處理6在相同時間21 d內(nèi)，其根數(shù)也僅增長至42條；可見，處理11在誘導出根后，其平均生根數(shù)增長速度最快。

圖2 3種處理的翠竹組培苗平均生根數(shù)

2.3.3不同植物生長調(diào)節(jié)劑配比對翠竹不同根長范圍內(nèi)平均生根數(shù)量及平均根長的影響

由表4可見：各個階段內(nèi)不同根長(L)級別的占比不同。處理4，010 cm的根出現(xiàn)。處理6、處理11，在生根后僅2周，2 cm10 cm的根數(shù)也在迅速增多。

移栽前進行的第7次統(tǒng)計結(jié)果表明，在對3種不同的植物生長調(diào)節(jié)劑組合處理進行誘導生根培養(yǎng)49 d后，處理4的平均生根數(shù)為48.83條，其中，010 cm的有1條(占2.40%)；處理6的平均生根數(shù)為41條，其中，010 cm的有1條(占3.66%)；處理11的平均生根數(shù)為50條，其中，010 cm的有3條(占7.64%)。結(jié)果表明，在同樣培養(yǎng)49 d后，處理11中，2 cm10 cm級別的根數(shù)都高于其他處理組。

由表4可見：3種處理平均根長的變化，處理4的平均根長增長速度最慢；處理6的平均根長增長速度最快，但其根數(shù)相對較少；處理11的平均根長增長速度較快，其根數(shù)也足夠多，且在49 d的生根培養(yǎng)過程中，處理11平均根長的峰值最高，可見其根系質(zhì)量最好。

表4 3種植物生長調(diào)節(jié)劑組合施用時翠竹不同根長范圍內(nèi)的平均生根數(shù)量及根平均長度

由以上結(jié)果分析可得，處理11有著較高的生根率，其平均生根數(shù)的增長速度最快，平均根長的增長速度也較快，培養(yǎng)結(jié)束后，其平均根長也最長。綜上所述，翠竹叢苗最佳生根培養(yǎng)基為“0.5倍的MS培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1的萘乙酸+質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的吲哚丁酸”。

2.4 不同基質(zhì)對移栽翠竹叢苗成活率的影響

煉苗后的翠竹叢苗移栽到3種基質(zhì)中后，做好水分管理，每日噴水2次，2周后統(tǒng)計3種基質(zhì)中叢苗的移栽成活率(見圖3)。體積比為V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1的基質(zhì)移栽成活率為100%，體積比為V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1的基質(zhì)移栽成活率為85%，體積比為V(壤土)∶V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1∶1的基質(zhì)移栽成活率為95%，說明將煉苗后的瓶苗移栽到體積比為V(壤土)∶V(蛭石)=1∶1的基質(zhì)中，成活效果最好。

a為無菌翠竹鞭芽萌發(fā)；b為叢芽誘導；c為叢芽增殖；d為生根培養(yǎng)；e為煉苗結(jié)束，移栽前的組培再生苗；f為盆栽組培苗。

3 結(jié)論與討論

20世紀80年代，翠竹作為優(yōu)質(zhì)觀賞竹種被引入南京林業(yè)大學竹種園。但由于竹子體內(nèi)內(nèi)生菌較多，組培污染率較高，其脫分化、再分化過程也較為困難，近30 a內(nèi)僅有張春霞等[9]以翠竹幼竹莖段為外植體進行了組培快繁研究。目前仍無以翠竹鞭芽為外植體構(gòu)建組培快繁體系的報道。

對于組培而言，無菌環(huán)境是其成功的關(guān)鍵，合適的外植體消毒方案十分重要。對于不同的外植體選取部位而言，其最適消毒方案間存在著較大差異。如王舒[10]認為，“體積分數(shù)為75%的酒精處理25 s+質(zhì)量分數(shù)為0.1%的HgCl2溶液處理5.3 min”的消毒方案，對黃甜竹稈芽側(cè)芽的消毒效果最好。王曙光等[11]將慈竹半木質(zhì)化枝條用體積分數(shù)為70%的酒精擦拭1遍，質(zhì)量分數(shù)為0.1%的升汞溶液消毒2次，每次12 min的效果最好。由于選用的外植體是帶有節(jié)的地下鞭段，與其他植物和竹類其他取材部位相比，地下鞭芽節(jié)大且堅韌，鞭芽被堅實的籜片包被，一定程度上影響了消毒液的殺菌效果。本研究表明，對翠竹鞭芽用體積分數(shù)為70%的酒精浸泡處理60 s，再用體積分數(shù)為2.5%的NaClO溶液處理15 min的消毒效果最佳。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，翠竹鞭芽內(nèi)生菌的潛伏期十分長，甚至在結(jié)束啟動培養(yǎng)進行增殖培養(yǎng)時仍發(fā)現(xiàn)有新的內(nèi)生菌污染的情況發(fā)生。

生長調(diào)節(jié)劑對植物組織培養(yǎng)而言意義重大，其種類的選擇及濃度配比是調(diào)控組培苗生長的主要途徑。本研究結(jié)果表明，在增殖培養(yǎng)階段，翠竹鞭芽最佳增殖培養(yǎng)基為“MS培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為5 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質(zhì)量濃度為0.30 mg·L-1的萘乙酸”，且發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)，增殖系數(shù)隨著6-芐氨基腺嘌呤質(zhì)量濃度的增加而增大，適量的生長素萘乙酸有助于芽苗保持生長活性，促進增殖，但過高的萘乙酸質(zhì)量濃度會使芽苗轉(zhuǎn)向增高生長，減緩增殖新芽的速度，這說明高質(zhì)量濃度的萘乙酸對苗高增高有益，但同時會抑制新芽產(chǎn)生。

芽叢誘導生根是竹類植物快繁體系構(gòu)建中的難題，傳統(tǒng)植物誘導生根只需進行生長素處理，但竹類植物不同，且不同竹種對生根培養(yǎng)基的要求差異巨大，需要通過改變植物生長調(diào)節(jié)劑的組合不斷進行嘗試。本研究表明，翠竹鞭芽叢苗最佳生根培養(yǎng)基為“0.5倍的MS培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的6-芐氨基腺嘌呤+質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1的萘乙酸+質(zhì)量濃度為0.5 mg·L-1的吲哚丁酸”。雖然配方“0.5倍的MS培養(yǎng)基+質(zhì)量濃度為1.5 mg·L-1的萘乙酸+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1的吲哚丁酸”生根最早，生根率較高，但其在誘導出根后，新根的增長速度和伸長速度都沒有前者高。這是因為早期在僅有萘乙酸、吲哚丁酸2種生長素的作用下，芽苗只進行生根活動，不進行芽苗的生長，所以出根最早。但在長期的生根培養(yǎng)過程中，芽苗本身出現(xiàn)了老化，上部生長的停滯使得生根速度也受到了一定影響。加入了細胞分裂素6-芐氨基腺嘌呤后，雖然早期需要進行一段時間的苗生長，但開始進行生根生長時，健壯的芽苗既可以穩(wěn)定其本身的長勢，也可以為生根活動提供一定的增益效果。王光萍等[12]研究表明，在誘導錦竹生根時，單一的生長素處理生根率較低，且很容易導致褐化，損傷植株，加入6-芐氨基腺嘌呤后該情況有所緩解。

前期翠竹的組培已有報道[9]，文中外植體材料采用的是翠竹莖段。而在本研究中考慮到翠竹的生物學特性，其竹鞭系統(tǒng)發(fā)達，材料充足，因而在本研究中改用鞭芽作為外植體材料，確保在外植體采集過程中不受到季節(jié)的限制。此外本研究詳細研究了不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對翠竹組培苗生根的影響，優(yōu)化了生根培養(yǎng)基配方。本研究對翠竹的再生體系進行了系統(tǒng)性的研究，可為后續(xù)其他竹種的再生體系建立提供參考。