柱前衍生-高效液相色譜法測定食品中的亞硝酸鹽

袁 圓，崔曉嬌，周金沙，尹芳平，黃 亮，夏煒杰

（長沙市食品藥品檢驗所&國家酒類產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測中心，湖南長沙 410000）

目前，有關亞硝酸鹽的檢測方法主要有離子色譜法[3-4]、分光光度法[5-6]、高效液相色譜法、氣相色譜法、熒光法、化學傳感器法和催化光度法等?，F(xiàn)行國標《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016）采用的是離子色譜法和分光光度法，但離子色譜法受高鹽食品中氯離子干擾較大，分光光度法則受色素的干擾較大。陳文生等[7]采用高效液相色譜法在204 nm 波長下測定亞硝酸根離子，此法前處理較簡單，但分析的基質(zhì)比較單一，且低波長下檢測可能存在干擾。目前，能同時不受色素、高鹽食品中氯離子影響且不受低波長干擾的液相色譜法未見報道。本研究參照《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》（GB 5009.33—2016），利用亞硝酸根離子與對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺衍生顯色生成紫紅色的偶氮化合物（目標物）進行柱前衍生，采用C18色譜柱對目標物進行分離，在高波長（480 nm）下進行檢測，可為含高鹽和色素等復雜基質(zhì)中亞硝酸鹽含量的測定提供技術支持和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白酒、威士忌、液體奶、腌肉和醬腌菜為市售樣品；陽性白酒、威士忌、液體奶均為實驗室自制。

肉制品中亞硝酸鹽質(zhì)控樣品（批號為CFAPAQC202107B-2，大連中食國實檢測技術有限公司）；亞硝酸鈉標準品（200.0 mg/L）、檸檬黃（純度96.2%）、新紅（純度88.9%）、莧菜紅（純度95.3%）、胭脂紅（純度89.8%）、日落黃（純度93.7%）、 亮 藍（ 純 度87.6%）、 赤 蘚 紅（ 純度86.0%）、誘惑紅（純度97.9%）和酸性紅（純度93.2%），均為北京曼哈格生物科技有限公司；乙酸銨、鹽酸萘乙二胺、乙酸鋅硼砂、對氨基苯磺酸和亞鐵氰化鉀，均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，色譜純，德國默克公司；實驗用水，法國Millipore 公司純水儀制備。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260 高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測器，美國安捷倫有限公司）；UV-2450 紫外可見分光光度計（島津國際貿(mào)易上海有限公司）；EOFO型數(shù)顯型多管式旋渦混合器（美國Talboys 公司）；Milli-Q Direct8 超純水儀（美國密理博公司）；超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

吸取2.50 mL 亞硝酸鈉標準溶液置于100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成5.0 mg/L 亞硝酸鈉標準使用液，吸取適量標準使用液，分別置于50 mL 帶塞比色管中，分別加入2 mL 的4 g/L 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min 后各加入1 mL 2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min 配成質(zhì)量濃度為0.015 ～0.250 mg/L 的系列工作溶液。

1.3.2 樣品處理

稱取威士忌、白酒10 g（精確到0.000 1 g）于50 mL 比色管中，加入30 mL 水，混勻備用；液體奶稱取10 g，醬腌菜和腌肉稱取2 g（精確到0.000 1 g）于150 mL 錐形瓶中，加入80 mL 水，超聲提取30 min。在75 ℃水浴中加熱5 min，取出放置至室溫，定量轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，分別加入2.5 mL 106 g/L 亞鐵氰化鉀溶液、2.5 mL 的220 g/L 乙酸鋅溶液，加水定容至刻度后搖勻，過濾，棄掉初濾液，取40 mL 濾液于50 mL 比色管中，分別加入2 mL 的4 g/L 對氨基苯磺酸溶液，混勻備用；各備用液中分別加入2 mL 的4 g/L 對氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min 后各加入1 mL 的2 g/L 鹽酸萘乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15 min，0.2 μm 親水PTFE微孔濾膜過濾，待高效液相色譜分析測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18(2)色譜柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流動相：甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨（35 ∶65，V∶V）；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；檢測波長：480 nm；進樣量：50 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 DAD 波長的選擇

為選取檢測的最佳波長，用二極管陣列檢測器對目標物進行全波長掃描，以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，如圖1 所示，目標物的最大吸收波長為480 nm，因此選擇檢測波長為480 nm。

圖1 目標物的光譜圖

2.2 流動相的優(yōu)化

（1）色素干擾。由于色素的紫外吸收波長與亞硝酸鹽顯色后的目標物類似，在紫外分光光度法中對亞硝酸鹽的測定有干擾。因此，為了消除色素在液相色譜法中產(chǎn)生的干擾，優(yōu)化色譜條件時需要將色素一起優(yōu)化，9 種食品中常見色素分別為檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍、赤蘚紅、誘惑紅和酸性紅。

（2）流動相體系。分別用甲醇-水、甲醇-0.1%乙酸、甲醇-0.01 mol/L 乙酸銨和甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨4 種體系的流動相分析測定目標物與9 種色素的混合標準溶液。結(jié)果表明，甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨流動相體系下目標物與9 種色素的分離效果最好，因此甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨體系被選為流動相。調(diào)節(jié)甲醇的比例，當甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨的體積比為35 ∶65 時，目標物與9 種色素可以有效分離，且響應最好，因此確定甲醇-0.02 mol/L 乙酸銨體積比為35 ∶65。

（3）不同pH 的乙酸銨溶液對出峰的影響。用冰乙酸調(diào)節(jié)乙酸銨溶液pH 為3、5 和7 作對比，由圖2 可知，pH=7 時，目標物與9 種色素分離效果最佳，保留時間最為適宜，因此選擇pH=7 的0.02 mol/L 乙酸銨作為流動相。

圖2 不同pH 乙酸銨溶液中目標物的色譜圖

2.3 干擾實驗

考查了與NO2-可能共存的9 種陰離子分別為和F-和與顯色后的目標物紫外吸收類似的9 種色素（檸檬黃、新紅、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、亮藍、赤蘚紅、誘惑紅和酸性紅）對本研究的干擾，由于9 種陰離子不能參與衍生反應，因此對目標物的分析不產(chǎn)生干擾，9 種色素的干擾實驗中，亮藍、次蘚紅和酸性紅不出峰，誘惑紅、日落黃和胭脂紅能與目標物完全分離，因此9 種色素對目標物的響應和分離完全無影響，此方法選擇性較好，適用于分析實際樣品中的亞硝酸鹽含量。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限

分別配制質(zhì)量濃度為0.015 mg/L、0.030 mg/L、0.060 mg/L、0.100 mg/L、0.150 mg/L 和0.250 mg/L的目標物標準工作溶液。在波長480 nm 下進行高效液相色譜分析，以質(zhì)量濃度（X，mg/L）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，得出線性回歸方程為Y=968.87X+0.11，r2=0.999 9，在0.015 ～0.250 mg/L，目標物的質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系。以信噪比（S/N≥3）計算方法得出檢出限，以信噪比（S/N≥10）計算方法得出定量限，威士忌、白酒、液體奶、醬腌菜和腌肉的檢出限分別為0.023 mg/kg、0.023 mg/kg、0.057 mg/kg、0.28 mg/kg 和0.28 mg/kg，定量限分別為0.075 mg/kg、0.075 mg/kg、0.19 mg/kg、0.94 mg/kg 和0.94 mg/kg，結(jié)果滿足檢測的要求。

2.5 精密度及回收率

在本方法條件下，采用空白樣品中添加標準溶液的方法，分別進行高、中、低3 個水平濃度加標，進行6 次重復實驗，測得平均回收率及相對標準偏差。每4 h 進高效液相色譜測定一次，計算方法的日內(nèi)精密度，以RSD 表示；每24 h 進高效液相色譜測定一次，連續(xù)測定3 d，計算方法的日間精密度，以RSD表示。由表1 可知，回收率范圍為83.3%～96.0%（n=6），精密度范圍為1.1%～5.3%；日內(nèi)精密度范圍為1.0%～3.8%（n=6）；日間精密度范圍為2.3%～7.8%（n=3），表明本方法可靠，符合檢測要求。

表1 方法的平均回收率和精密度

2.6 分光光度法與柱前衍生-高效液相色譜法的比對

采用GB 5009.33—2016 中的第二法分光光度法和本方法建立的高效液相色譜法同時測定肉制品中亞硝酸鹽質(zhì)控樣品、醬腌菜、腌肉和自制陽性威士忌、白酒、液體奶中亞硝酸鹽含量，每個樣品平行測定3 次，兩種方法測定質(zhì)控樣的結(jié)果（取3 次測定平均值）見表2。由表2 可知，肉制品中亞硝酸鹽質(zhì)控樣品亞硝酸鹽（以亞硝酸鈉計）的指定值為1.89 mg/kg，標準差為0.34 mg/kg，兩種方法|z|值均小于2，結(jié)果均為滿意。兩種方法測得其他樣品中亞硝酸鹽含量結(jié)果RSD 在5%以內(nèi)，無顯著性差異，說明高效液相色譜法測定亞硝酸鹽含量準確可靠。

表2 兩種方法測定質(zhì)控樣中亞硝酸鹽結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本研究建立了柱前衍生-高效液相色譜法檢測食品中亞硝酸鹽的方法。測定實際樣品和質(zhì)控樣品中亞硝酸鹽含量的結(jié)果比對，驗證了該方法的適用性與準確性。該方法能夠有效消除氯離子等其他陰離子和色素對檢測的干擾，建立的分析方法靈敏度、準確度、精密度和回收率好，適用于食品中亞硝酸鹽的檢測。