基于煙草脆裂病毒構(gòu)建同時表達2種外源蛋白的載體及其應(yīng)用*

郭 歌 常發(fā)光 賴家良 張先文 杜志游 廖乾生**

（1）浙江理工大學(xué)生命科學(xué)院與醫(yī)藥學(xué)院，杭州 310018；2）浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)實驗站，杭州 310058）

隨著大量植物基因組測序的完成，迫切需要一個好的載體或技術(shù)來快速地分析基因組中新基因或預(yù)測蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能［1-2］。目前，研究功能未知的基因或蛋白質(zhì)主要通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在植物中表達目的蛋白以證實其功能［3］，但轉(zhuǎn)基因技術(shù)存在操作繁瑣、周期長及物種限制等制約因素，利用植物病毒載體探究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能日益成為一種趨勢［4-5］。

病毒復(fù)制/翻譯效率高，可在植物中產(chǎn)生大量病毒蛋白，且基因組小易操作，大量植物病毒被用作構(gòu)建外源蛋白表達載體的來源，但絕大多數(shù)植物病毒載體是表達單個外源蛋白［6-7］。馬鈴薯X 病毒（potato virus X，PⅤX）和煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMⅤ）是目前最常用植物病毒表達載體［8-9］。越來越多植物病毒用于構(gòu)建表達多個外源蛋白的載體，由2 個TMⅤ不同株系的cp亞基因組啟動子構(gòu)建表達載體pGR30B在本氏煙中能同時表達2個不同外源蛋白，但因缺失病毒cp基因，該載體只能在病毒接種葉產(chǎn)生目的蛋白［10］；Wang等［11］將TMⅤcp亞基因組啟動子和PⅤX的cp亞基因組啟動子插入PⅤX 基因組中獲得表達載體pCaPⅤX440，該病毒能在整個寄主植物中同時表達2個外源蛋白，但重組病毒的穩(wěn)定性有待于進一步分析。大麥條紋花葉病毒（barely stripe mosaic virus，BSMⅤ） 為三分體正義單鏈RNA 病毒，Cheuk 等［12］將其改造成四分體病毒，用于在寄主植物中同時表達2個外源蛋白；基于甜菜壞死黃脈病毒（beet necrotic yellow vein virus，BNYⅤS）表達載體能同時表達4個外源蛋白，但該載體只能在本氏煙rdr6i 接種葉中同時表達4 個目的蛋白［13］。利用多聚體蛋白水解策略或肽酶切割原理基于植物病毒構(gòu)建的多個蛋白質(zhì)表達載體在寄主中產(chǎn)生的目的蛋白含有源于病毒蛋白或肽酶的氨基酸殘基［14-16］，而目的蛋白攜帶其他的氨基酸殘基可能干擾其生物學(xué)功能。目前已有多個負鏈RNA 病毒用作構(gòu)建多個外源蛋白的表達載體來源，如利用大麥黃色條點花葉病毒（barley yellow striate mosaic virus，BYSMⅤ）表達3 個外源蛋白［17］，基于番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt virus，TSWⅤ）構(gòu)建的外源蛋白表達載體在本氏煙中能同時表達綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和紅色熒光蛋 白（red fluorescent protein，RFP）［18］，Peng等［19］利用苦苣菜黃網(wǎng)病毒（sonchus yellow net rhabdovirus，SYNⅤ）在本氏煙中同時表達抗體蛋白ⅠgG 的重鏈和輕鏈多肽。盡管負鏈RNA 能在整個寄主植物中穩(wěn)定地同時表達多個外源蛋白，但病毒基因組較大，克隆過程復(fù)雜，在病毒接種過程中需要外源表達病毒的復(fù)制酶和基因沉默抑制子，實驗操作繁瑣，且負鏈RNA 病毒表達外源蛋白需要時間周期長［17-19］。

煙草脆裂病毒（tobacco rattle virus，TRⅤ）是煙草脆裂病毒屬（Tobraνirus）的典型成員，寄主范圍廣，能侵染超過50 種單子葉和雙子葉家族的400 多種植物［20-22］。TRⅤ為正義單鏈RNA 病毒，基因組由RNA1 和RNA2 分子組成。RNA1 所編碼的4 個蛋白質(zhì)參與病毒的復(fù)制、移動以及癥狀產(chǎn)生，RNA2 中包含3 個開放閱讀框（ORF），編碼CP、27 ku 的2b 和18 ku 的2c，TRⅤ基因組RNA2中2b和2c基因完全缺失后病毒依然能在植物中的復(fù)制、包被和移動［23-24］。TRⅤ寄主范圍廣泛，引起的癥狀反應(yīng)相對溫和，目前被用于構(gòu)建病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，ⅤⅠGS）載體、外源蛋白表達載體和產(chǎn)生引導(dǎo)RNA 的基因編輯體［5，25-29］。

目前國內(nèi)外基于植物病毒構(gòu)建多個蛋白質(zhì)表達載體，因選擇的病毒特性不一樣，存在不同類型缺點：a.表達多個蛋白質(zhì)的重組病毒不能系統(tǒng)性侵染寄主植物；b.外源基因插入影響病毒基因組的完整性，使得外源蛋白不能有效表達；c.病毒載體在植物中產(chǎn)生的外源蛋白含有非目的蛋白氨基酸殘基；d.表達目的蛋白需要較長的時間，且表達量低。本文通過缺失TRⅤ基因組RNA2 侵染性克隆（pYL156）中2b基因的279堿基、引入豌豆早枯病毒（pea early-browning virus，PEBⅤ）cp亞基組啟動子序列，獲得載體pTRⅤ2e2，通過重組病毒TRⅤe2中自身攜帶2c亞基組啟動子和外源插入cp亞基組啟動子在本氏煙整個植株中同時表達2個非融合外源蛋白，并利用其分析蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒和菌株

質(zhì) 粒pTRⅤ1、 pYL156 （pTRⅤ2）、 pUC57-PEBⅤCP pro、pBⅠ121-gfp、pBⅠ121-rfp、pCMBⅠAAtGapC2、 pCAMBⅠA-NbHsp70、 pBⅠ121-LS2b、pUC57-XEG1、pUC57-Aνh52 和大腸桿菌DH5α 菌株及農(nóng)桿菌GⅤ3101菌株均保存于本實驗室。

1.1.2 寄主植物

本氏煙（Nicotiana benthamiana）寄主植物，播種后～10 d 后移栽，在25℃、16 h/8 h（光照/黑暗）光周期條件下培養(yǎng)至6～8葉期，用于農(nóng)桿菌浸潤接種。

1.2 方法

1.2.1 載體構(gòu)建

以質(zhì)粒pYL156 為模板，通過引物對P1/P2 進行PCR 擴增，目的產(chǎn)物割膠回收后經(jīng)Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ雙 酶 切，并 連 接 到Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ的 載 體pYL156 中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，獲得重組質(zhì)粒pTRⅤ2e1。以pUC57-PEBⅤCP pro為模板，通過引物對P3/P4進行擴增獲得PEBⅤCP基因啟動子序列，通過MluⅠ/SmaⅠ雙酶切克隆至pTRⅤ2e1中，獲得克隆pTRⅤ2e2。采用引物對P5/P6進行PCR 擴增獲得基因gfp，經(jīng)EcoRⅠ/MluⅠ雙酶切連 接 質(zhì) 粒pTRⅤ2e1/pTRⅤ2e2， 分 別 獲 得 載 體pTRⅤ2e1-gfp/pTRⅤ2e2-gfp-MCS2。通過引物對P7/P8進行PCR擴增，目的產(chǎn)物割膠回收，經(jīng)BamHⅠ/SmaⅠ雙 酶 切 克 隆 至 質(zhì) 粒pTRⅤ2e2中 獲 得 載 體pTRⅤ2e2-MCS1-gfp。通過引物對P9/P10 進行rfp基因的PCR 擴增，目的片段通過EcoRⅠ/MluⅠ雙酶切回收并克隆至pTRⅤ2e2-MCS1-gfp，獲得到載體TRⅤ2e2-rfp-gfp。通過引物對P11/P12 擴增含有HA標(biāo)簽序列g(shù)fp基因，并通過經(jīng)BamHⅠ/SmaⅠ雙酶切克隆至質(zhì)粒pTRⅤ2e2，獲得pTRⅤ2e2-MCS1-gfp-HA。通過引物對P13/P14 進行擴增基因GapC2，并通過經(jīng)BamHⅠ/SmaⅠ雙酶切克隆至載體pTRⅤ2e2-MCS1-gfp-HA，獲得pTRⅤ2e2-MCS1-GapC2-HA。通過引物對P15/P16 進行擴增基因Hsp70，并通過經(jīng)BamHⅠ/SmaⅠ雙酶切克隆至載體pTRⅤ2e2-MCS1-gfp-HA，獲得pTRⅤ2e2-MCS1-gfp-HA。通過引物對P17/P18 擴增CMⅤ-LS2b基因，經(jīng)EcoRⅠ/MluⅠ雙酶切 連 接 質(zhì) 粒pTRⅤ2e2-MCS1-gfp， 獲 得 載 體pTRⅤ2e2-2b-gfp。通過引物對P19/P20 進行PCR 擴增獲得XEG1，并通過雙酶切克隆到載體pTRⅤ2e2中，獲得pTRⅤ2e2-XEG1-MCS2。通過P21/P22 引物對PCR 擴增獲得Aνh52，通過BamHⅠ/SmaⅠ雙酶切分別克隆到載體pTRⅤ2e2/pTRⅤ2e2-XEG1-MCS2，分別獲得pTRⅤ2e2-MCS1-Aνh52 和pTRⅤ2e2-XEG1-Aνh52。構(gòu)建載體所用引物詳細信息見附件表S1。

1.2.2 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化、接種和病毒表型觀察

上述構(gòu)建的pYL156 相關(guān)載體均采用凍融法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中GⅤ3101，農(nóng)桿菌活化與培養(yǎng)、菌體收集、浸潤接種的具體方法參考劉妮娜等［30］。農(nóng)桿菌pTRⅤ1 與pYL156 混 和 物 為TRⅤ、pTRⅤ1 與pTRⅤ2e1混和物為TRⅤe1、pTRⅤ1 與pTRⅤ2e2混和物為TRⅤe2。在暗室中用長波型手提便攜式紫外燈觀察到本氏煙葉片熒光表型，并用攜帶Wratten 過濾器15 的柯達照相機拍照記錄，汁液摩擦接種的方法參考廖乾生等［31］。

1.2.3 植物總RNA提取和RNA印跡

取各個病毒侵染的系統(tǒng)葉0.1 g，用Trizol提取總RNA，具體過程按照Trizol 產(chǎn)品說明書進行。RNA 電泳、轉(zhuǎn)膜和雜交方法參考地高辛標(biāo)記檢測試劑盒ⅠⅠ產(chǎn)品使用說明書，雜交探針為互補于RNA2的3'端一段核苷酸，探針的詳細信息見附件表S1。TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-2b-gfp侵染植株中g(shù)fp的siRNA 雜交具體方法參考文獻Du 等［32］，siRNA 探針詳細信息見附件表S1。TRⅤ基因組RNA2和gfp的siRNA雜交信號采用軟件Ⅰmage J量化處理，并通過SPASS 軟件分析數(shù)據(jù)，以TRⅤe2-MCS1-gfp量為100%，計算TRⅤe2-2b-gfp相對含量及標(biāo)準(zhǔn)誤差。

1.2.4 植物總蛋白質(zhì)提取與免疫印跡

分別取各個相應(yīng)病毒侵染植物的系統(tǒng)葉0.1 g，液氮研磨至粉末狀，加入含2%β-巰基乙醇的PBS緩沖液研磨至均一狀液體，離心后取上清并加入2×上樣緩沖液，95℃水浴煮10 min，10 000 r/min 5 min，取上清備用。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜、抗體雜交和底物顯色的方法參考文獻［33］，所用抗體為GPF、RFP、HA 標(biāo)簽和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMⅤ）2b 蛋白。TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-2b-gfp侵染植株中GFP 雜交結(jié)果采用軟件Ⅰmage J量化處理，并通過SPASS 軟件分析數(shù)據(jù)，以TRⅤe2-MCS1-gfp量為100%，計算TRⅤe2-2b-gfp相對含量及標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與討論

2.1 TRV2相關(guān)載體構(gòu)建及侵染活性

TRⅤ基因組由RNA1 和RNA2 組成，基因組RNA1 單獨能系統(tǒng)性侵染寄主植物［23］，由TRⅤ基因組RNA2 改造而成的載體（pYL156）是目前廣泛地應(yīng)用于植物功能基因組學(xué)研究重要工具之一［5，26，34］；此外，利用PEBⅤ的cp亞基因組啟動子構(gòu)建外源蛋白的表達載體［35-37］。在pYL156載體中，TRⅤ基因組RNA2 中第1 643～3 465 區(qū)域堿基缺失，保留2b 蛋白N 端101 個氨基酸，完全缺失2c啟動子和ORF［34］。Morton等［37］將pYL156載體中2b蛋白N端101個氨基酸完全缺失，并引入2個PEBⅤcp基因亞基因組啟動子，構(gòu)建同時表達2個外源蛋白的載體，本文基于載體pYL156構(gòu)建含有TRⅤ的2b和PEBⅤcp亞基因組啟動子外源蛋白表達 載 體。pYL156、pTRⅤ2e1和pTRⅤ2e2載 體 中TRⅤ基因組RNA2 結(jié)構(gòu)示意圖如圖1a 所示，pYL156 中RNA2 含有2b基因ORF 的5'端303 bp。通過缺失2b基因ORF 的5'端279 bp，將2b基因的起始密碼子（ATG）改為AGG，獲得pTRⅤ2e1載體。在pTRⅤ2e1載體中，引入PEBⅤcp基因亞基因組啟動子構(gòu)建載體pTRⅤ2e2。為了分析改造后的TRⅤ基因組RNA2 是否具有侵染活性，將農(nóng)桿菌pYL156、pTRⅤ2e1和pTRⅤ2e2分別與農(nóng)桿菌pTRⅤ1混和物共同浸潤接種于本氏煙，浸潤接種5 d，TRⅤe1和TRⅤe2侵染寄主植物后不產(chǎn)生明顯的癥狀反應(yīng)，與Mock 接種相似，而TRⅤ（TRⅤ1+pYL156）侵染則引起葉片壞死表型（圖1b），與程維舜等［38］報道的結(jié)果相一致。Northern blot 分析結(jié)果表明，在寄主植物的系統(tǒng)葉均能檢測到TRⅤ、TRⅤe1和TRⅤe2基因組RNA，因TRⅤe1中缺失2b基因ORF的5'端279 bp，其基因組RNA2長度明顯比TRⅤ小（圖1c），以上結(jié)果表明重組病毒TRⅤe1和TRⅤe2均可系統(tǒng)性侵染寄主植物。

2.2 2b和cp啟動子驅(qū)動的外源蛋白表達

Fig.1 Infection assays of expression vectors based on tobacco rattle virus in Nicotiana benthamiana plants

為了確定病毒載體TRⅤe1和TRⅤe2中亞基組啟動子能否驅(qū)動外源蛋白的表達，構(gòu)建載體pTRⅤ2e1-gfp和pTRⅤ2e2-MCS1-gfp和pTRⅤ2e2-rfpgfp（圖2a）。病毒TRⅤe1-gfp、TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-rfp-gfp接種本氏煙24 h，3 個病毒的浸潤接種葉在熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光現(xiàn)象（結(jié)果未顯示）；接種5 d的植株熒光表型如圖2b所示，除了TRⅤe1對照接種的本氏煙外，TRⅤe1-gfp和TRⅤe2-MCS1-gfp侵染的寄主系統(tǒng)葉中均產(chǎn)生綠色熒光，TRⅤe2-rfp-gfp侵染植株的系統(tǒng)葉呈現(xiàn)亮黃色表型。TRⅤe2-rfp-gfp侵染植株系統(tǒng)葉在激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果如圖2c 所示，在本氏煙同一個細胞中能同時觀察到綠色熒光和紅色熒光，表明TRⅤe2-rfp-gfp能同時表達GFP 和RFP。免疫印跡（Western blot）分析結(jié)果表明，GFP 抗體可以在TRⅤe1-gfp、TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-rfp-gfp侵染寄主植物系統(tǒng)葉的總蛋白中檢測到目的蛋白，而對照接種TRⅤe1則檢測不到GFP 信號；在TRⅤe2-MCS1-gfp的樣品中目的條帶信號強度明顯高于TRⅤe1-gfp（圖2d），表明前者侵染寄主植物中GFP表達量高于后者，與觀察到的綠色熒光表型一致。在TRⅤe2-rfp-gfp侵染的本氏煙植株總蛋白能同時檢測到GFP和RFP（圖2d），以上結(jié)果表明病毒載體TRⅤe2能在整個寄主植物中同時快速地表達2 個外源蛋白。

Fig.2 Expression of green fluorescent protein and red fluorescent protein in the whole host plants via TRVe2 vector

2.3 兩個啟動子表達外源蛋白能力的比較

為了比較載體pTRⅤ2e2中2 個亞基組啟動子驅(qū)動外源蛋白表達能力，構(gòu)建載體pTRⅤ2e2-gfp-MCS2 和pTRⅤ2e2-MCS1-gfp，兩者中的gfp基因分別由TRⅤ內(nèi)源2b亞基因組啟動子和PEBⅤcp亞基因組啟動子驅(qū)動表達（圖3a）。病毒TRⅤe2-gfp-MCS2 和TRⅤe2-MCS1-gfp接種5 d，紫外燈下觀察寄主植物熒光表型如圖3b 所示，在本氏煙接種葉和系統(tǒng)葉中，TRⅤe2-MCS1-gfp侵染引起的熒光現(xiàn)象 明 顯 強 于 TRⅤe2-gfp-MCS2。 RNA 印 跡（Northern blot）結(jié)果顯示，2 個病毒在侵染寄主植物接種葉和系統(tǒng)葉病毒基因組RNA 含量基本相同（圖3c）。Western blot 進一步證實，在接種葉和系統(tǒng)葉中病毒TRⅤe2-MCS1-gfp所產(chǎn)生的GFP 量均高于TRⅤe2-gfp-MCS2（圖3c）。以上結(jié)果表明，病毒TRⅤe2中PEBⅤcp基因亞基因組啟動子驅(qū)動外源蛋白表達能力強于TRⅤ2b基因亞基因組啟動子。

2.4 利用TRVe2表達不同長度的外源蛋白

為了分析病毒TRⅤe2對不同長度外源基因的表達能力，分別將基因gfp（720 bp）、擬南芥三磷酸甘油醛脫氫酶C2 亞基基因GapC2（1 017 bp）、煙草熱激蛋白70 基因Hsp70（1 950 bp）克隆至載體pTRⅤe2中， 獲 得 載 體pTRⅤ2e2-MCS1-gfp-HA、pTRⅤ2e2-MCS1-GapC2-HA 和 pTRⅤ2e2-MCS1-Hsp70-HA； 病 毒TRⅤe2-MCS1-gfp-HA、 TRⅤe2-MCS1-GapC2-HA 和TRⅤe2-MCS1-Hsp70-HA 接 種接種寄主植物5 d，分別采集寄主植物系統(tǒng)葉用于Northern blot 雜交和Western blot 分析，結(jié)果如圖4所示。在pTRⅤ2e2載體插入不同長度的基因后，重組病毒基因組RNA2 長度增加（圖4a）；通過HA抗體在各個病毒接種寄主的系統(tǒng)葉中均能夠檢測到目的蛋白（圖4b）。以上結(jié)果表明，病毒TRⅤe2在本氏煙系統(tǒng)葉中至少能表達70 ku 外源蛋白。TRⅤ基因組RNA1 的大小為～6.8 kb，RNA2 大小為～3.9 kb，病毒粒子呈直桿狀［20-24，39］，本文構(gòu)建TRⅤ2e2載體中TRⅤ2 基因組大小為～2 kb，病毒TRⅤe2能在整個植株中表達～2.0 kb外源基因，完全符合預(yù)期。病毒TRⅤe2在寄主植物中能否表達2.0 kb 以上外源基因、并能在寄主中系統(tǒng)移動的相關(guān)工作本實驗室正在進行中。

Fig.4 Expression of various proteins in N.benthamiana plants with TRVe2

2.5 TRVe2在寄主中保持穩(wěn)定

為了分析病毒TRⅤe2攜帶外源基因后在寄主植物穩(wěn)定性，取TRⅤe2-MCS1-Hsp70-HA 農(nóng)桿菌浸潤接種10 d寄主系統(tǒng)葉，通過汁液摩擦轉(zhuǎn)接于健康本氏煙中，連續(xù)進行3 次轉(zhuǎn)接。分別采集3 次轉(zhuǎn)接寄主系統(tǒng)葉用于病毒基因組雜交和蛋白質(zhì)檢測。結(jié)果（圖5）表明，TRⅤe2-MCS1-Hsp70 在3 次轉(zhuǎn)接植株中的病毒基因組RNA2積累量與大小與農(nóng)桿菌浸潤接種寄主相比無明顯差別，插入到TRⅤ基因組RNA2 中外源基因Hsp70 不丟失；在病毒侵染植株系統(tǒng)葉的總蛋白質(zhì)中均能檢測到Hsp70，并且Hsp70含量在3次轉(zhuǎn)接的植株中含量沒有明顯差別，病毒TRⅤe2在攜帶～2.0 kb外源基因后可以穩(wěn)定存在于寄主植物中，并在整個寄主植物中表達目的蛋白。

Fig.5 Analysis of stability of TRVe2-MCS1-Hsp70-HA by serial passages in N.benthamiana plants

2.6 利用TRVe2驗證CMV 2b基因沉默抑制子的功能

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMⅤ）的2b 蛋白是基因沉默抑制子，抑制寄主植物對CMⅤ抗病反應(yīng)［33］。本文構(gòu)建病毒載體TRⅤe2-2b-gfp用于驗證CMⅤ的2b 蛋白具有抑制基因沉默功能。病毒接種3 d，TRⅤe2-2b-gfp在寄主植物接種葉中熒光強度明顯高于TRⅤe2-MCS1-gfp；病毒接種5 d，2 個病毒均擴展至本氏煙的系統(tǒng)葉，并且TRⅤe2-2b-gfp熒光表型強于TRⅤe2-MCS1-gfp（圖6a）。在TRⅤe2-2b-gfp侵染本氏煙系統(tǒng)葉能檢測到2b蛋白，與TRⅤe2-MCS1-gfp相比，TRⅤe2-2b-gfp侵染植株中GFP 含量增加2.2 倍（圖6b）。為了確定病毒TRⅤe2-MCS1-gfp表達CMⅤ2b 蛋白后是否也增加TRⅤ的基因組積累量，分別提取TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-2b-gfp所侵染寄主植物系統(tǒng)葉總RNA 和siRNA 用于Northern blot 分析。結(jié)果表明：TRⅤe2-2b-gfp在本氏煙中的基因組RNA含量是TRⅤe2-MCS1-gfp的4.67 倍（圖6c），表明TRⅤe2-2b-gfp引起本氏煙產(chǎn)生更明顯的熒光表型是由于TRⅤe2-2b-gfp表達CMⅤ的2b 蛋白增加病毒基因組RNA 所導(dǎo)致.TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-2b-gfp侵染植株的gfp-siRNA 雜交結(jié)果表明，siRNA 在TRⅤe2-MCS1-gfp侵染寄主中含量高于TRⅤe2-2b-gfp（圖6d）。以上結(jié)果表明，病毒TRⅤe2可用于研究蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

Fig.6 Application of the TRV-based dual expression vector for analysis of CMV 2b protein involved in antiviral defense response on N.benthamiana plants

2.7 利用TRVe2分析XEG1和Avh52的相互作用

XEG1是來自于大豆疫霉菌的激發(fā)子，PⅤX載體表達XEG1蛋白后，在本氏煙上引發(fā)植物的防御反應(yīng)，導(dǎo)致葉片呈現(xiàn)壞死癥狀，而預(yù)先在本氏煙中表達RXLR 效應(yīng)子Avh52 后再表達XEG1，XEG1引起的細胞壞死反應(yīng)則被抑制［40］。本文利用質(zhì)粒pTRⅤ2e2分別構(gòu)建單獨表達XEG1 或Avh52，同時表達XEG1 和Avh52 的載體；農(nóng)桿菌浸潤接種36 h，接種病毒TRⅤe2-XEG1-MCS2 的葉片呈現(xiàn)壞死表型，TRⅤe2-XEG1-Aνh52 侵染的葉片無明顯壞死癥狀，TRⅤe2-MCS1-gfp和TRⅤe2-MCS1-Aνh52 的接種葉均不產(chǎn)生壞死癥狀（圖7a），與Ma等［40］報道的結(jié)果相一致。Western blot 結(jié)果顯示，TRⅤe2-XEG1-MCS2、TRⅤe2-XEG1-Aνh52 和TRⅤe2-MCS1-Aνh52浸潤接種的葉片中均能檢測到相應(yīng)目的蛋白（圖7b）。以上結(jié)果表明，病毒TRⅤe2可用于分析2個蛋白質(zhì)之間的相互作用。

Fig.7 Application of the TRV-based dual vector for analysis of suppression of XEG1-induced cell death in N.benthamiana leaves by RXLR effector Avh52

3 結(jié) 論

本文利用TRⅤ基因組RNA2農(nóng)桿菌侵染性克隆pYL156 構(gòu)建含有2 個亞基因組啟動子的載體pTRⅤ2e2，并用于在本氏煙整個植株中同時表達2個外源蛋白，主要結(jié)論如下：a.病毒TRⅤe2能系統(tǒng)性侵染本氏煙，并通過病毒基因組RNA2中的2個亞基因組啟動子在整個植株中同時快速、高含量地表達2 個非融合外源蛋白；b.病毒TRⅤe2至少能表達大小為70 ku 非融合外源蛋白；c. 重組病毒TRⅤe2攜帶外源基因后能在寄主植物保持穩(wěn)定；d.病毒TRⅤe2可用于快速分析蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作。本文結(jié)果為利用植物病毒構(gòu)建表達多個非融合蛋白載體提供理論指導(dǎo)，表達載體TRⅤe2為快速研究植物的基因功能提供技術(shù)工具。

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