響應(yīng)曲面法優(yōu)化還原型特利加壓素氧化工藝研究

史文青 葛傳軍 陳 冉 董世建 李增禮 王榮海 許 培*

(安徽安科生物工程＜集團(tuán)>股份有限公司,合肥 安徽 230088)

特利加壓素(Terlipressin)為化學(xué)合成多肽化合物,臨床用于治療嚴(yán)重急性食管靜脈曲張破裂出血,嚴(yán)重急性胃、十二指腸潰瘍出血,急性糜爛性胃炎或出血性胃炎,對(duì)肝硬化頑固性腹水具有一定療效,聯(lián)合白蛋白治療可以顯著提高Ⅰ型肝腎綜合征的緩解率、減低死亡率[1-3]。

其分子式為：C52H74N16O15S2,分子量為1227.4。

結(jié)構(gòu)式為：H-Gly-Gly-Gly-c(Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys)-Pro-Lys-Gly-NH2

還原型特利加壓素肽鏈上不同位置的半胱氨酸之間形成的二硫鍵,可以將肽鏈折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)。二硫鍵是蛋白質(zhì)或多肽分子中兩個(gè)不同位點(diǎn)半胱氨酸(Cys)的巰基(-SH)被氧化形成的S-S 共價(jià)鍵。二硫鍵在維持多肽的空間立體結(jié)構(gòu)及由此決定的生物活性中發(fā)揮著重要的作用,特利加壓素需要二硫鍵的存在才具有活性。形成二硫鍵的方法有很多：空氣氧化法,DMSO 氧化法,過氧化氫氧化法等[4-6]。本研究采用30%過氧化氫為氧化劑對(duì)還原型特利加壓素進(jìn)行氧化過程研究。

QbD(質(zhì)量源于設(shè)計(jì))重要理念之一是產(chǎn)品的質(zhì)量無法通過檢驗(yàn)賦予,而是通過設(shè)計(jì)賦予的。研究者應(yīng)對(duì)工藝路線及工藝參數(shù)進(jìn)行全面的篩選研究,以加強(qiáng)對(duì)產(chǎn)品性能知識(shí)的了解。如ICH Q8 中提出,研究者可以對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估后加以調(diào)整和優(yōu)化,明確各個(gè)變量的重要性及其潛在的相互作用。一旦確定了重要參數(shù),可以對(duì)其作進(jìn)一步研究(如通過試驗(yàn)設(shè)計(jì)組合、數(shù)學(xué)模型或相關(guān)的機(jī)理研究),從而對(duì)工藝有更深的了解[7]。在藥品研發(fā)工作中,常需要研究響應(yīng)值y 究竟如何依賴于自變量,進(jìn)而找到自變量的設(shè)置,使得響應(yīng)值得到最佳值(望大、望小或望目)。響應(yīng)曲面法(RSM)是目前國際上較為流行的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析方法,可用于定量分析各因子及交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響[8-9]。本研究以氧化率為響應(yīng)值,通過響應(yīng)曲面法,獲得還原型特利加壓素的最佳氧化工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

還原型特利加壓素(批號(hào)211201-F01-01, 肽含量68%)由安徽安科生物工程(集團(tuán))股份有限公司提供。

醋酸特利加壓素(批號(hào)150701-202002)購自中國食品藥品檢定研究院；30%過氧化氫(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸(分析純)購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉(藥用輔料)購自湖南爾康制藥股份有限公司；磷酸二氫鈉(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸(HPLC 級(jí))購自美國ACS 科恩化學(xué)公司；乙腈(HPLC 級(jí))購自美國TEDIA 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ML304T/02 型電子天平購自瑞士 METTLER TOLEDO 公 司；FE28 型pH 計(jì) 購 自 瑞 士METTLER TOLEDO 公司；DF-101S 型集熱式磁力攪拌器購自常州國宇儀器制造有限公司；KDC-0510 型低溫恒溫槽購自南京肯凡電子科技有限公司；LC-20AT 型高效液相色譜儀購自日本Shimadzu 公司。

1.3 方法

1.3.1 含量測定

1.3.1.1 色譜條件

采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相A 為0.067mol/L 磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)pH 值至3.5),流動(dòng)相B 為乙腈；線性梯度洗脫：0～4min：8%B→8%B,4～18min：8%B→15%B,18～30min：15%B→20%B,30～30.1min：20%B→8%B,30.1～40min：8%B→8%B；檢測波長為210nm；柱溫：28℃。

1.3.1.2 測定法

取本品適量,精密稱定,加水溶解并稀釋制成每1ml中約含特利加壓素0.2mg 的溶液,精密量取20μl 注入液相色譜儀,記錄色譜圖；另取醋酸特利加壓素對(duì)照品適量,同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算,即得。

1.3.2 氧化率

由1.3.1 測定樣品含量,氧化率如下式計(jì)算：

1.3.3 還原型特利加壓素氧化工藝

將一定量還原型特利加壓素置于洗凈并干燥的燒杯,加入一定量純化水?dāng)嚢枞芙?攪拌轉(zhuǎn)速500 轉(zhuǎn)/min),完全溶解(目測無可見不溶顆粒)后,用1mol/L 氫氧化鈉水溶液將粗品溶液pH 調(diào)節(jié)至設(shè)定值,加入30%雙氧水,控制好氧化劑與樣品摩爾比(以還原型特利加壓素計(jì)算),以500 轉(zhuǎn)/min 轉(zhuǎn)速在一定溫度條件下攪拌反應(yīng)液,反應(yīng)結(jié)束后,用冰醋酸將粗品溶液pH 調(diào)節(jié)至3.0 終止氧化反應(yīng),即刻取樣檢測樣品含量。

1.3.4 還原型特利加壓素氧化工藝部分析因試驗(yàn)

根據(jù)部分析因試驗(yàn)的基本原理[8],以氧化率為響應(yīng)值,對(duì)氧化工藝進(jìn)行因子篩選試驗(yàn),運(yùn)用分析軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,比較反應(yīng)時(shí)間、樣品濃度(以還原型特利加壓素計(jì)算)、反應(yīng)pH、氧化劑與樣品摩爾比(以還原型特利加壓素計(jì)算)、反應(yīng)溫度對(duì)氧化工藝的影響。

1.3.5 響應(yīng)曲面法優(yōu)化還原型特利加壓素氧化工藝

根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[8],以氧化率為響應(yīng)值,對(duì)氧化工藝進(jìn)行優(yōu)化,運(yùn)用分析軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì),并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,獲得最優(yōu)氧化條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 還原型特利加壓素氧化工藝因子篩選試驗(yàn)

通過風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估確定還原型特利加壓素氧化工藝的五個(gè)主要因子：反應(yīng)時(shí)間、樣品濃度(以還原型特利加壓素計(jì)算)、反應(yīng)pH、氧化劑與樣品摩爾比(以還原型特利加壓素計(jì)算)、反應(yīng)溫度分別用X1,X2,X3,X4,X5表示。根據(jù)部分析因試驗(yàn)的基本原理,以氧化率為響應(yīng)值,對(duì)氧化工藝的五個(gè)因子進(jìn)行五因子二水平三中心點(diǎn)(分辨度Ⅴ)的因子篩選試驗(yàn)。

根據(jù)表1,設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)時(shí)間、樣品濃度(以還原型特利加壓素計(jì)算)、反應(yīng)pH、氧化劑與樣品摩爾比(以還原型特利加壓素計(jì)算)、反應(yīng)溫度,進(jìn)行19 次試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 部分析因試驗(yàn)因子水平及編碼

表2 部分析因試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

采用分析軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,得到回歸模型如下：

Y(%)=1.055-0.00130X1-0.0443X2-0.0279X3-0.00002 X4-0.00013X5+0.000560X1X2+0.000044X1X3-0.000025X1X4+0.000006X1X5+0.00580X2X3-0.000365X2X4-0.000355X2X5+0.000149X3X4+0.000100X3X5+0.000006X4X5+0.04752CtPt,模型方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析

由表3 可以看出,一次項(xiàng),X3顯著；X1,X5具有一定顯著性；其余項(xiàng)均不顯著,將雙因子交互作用刪除,優(yōu)化后的模型如下：

Y(%)=0.9243-0.000314X1-0.00194X2-0.008753X3-0.000226X4+0.000253X5+0.04752CtPt,模型方差分析見表4。

表4 回歸模型方差分析

由表4 可以看出,X1,X3,X5均顯著；X2,X4不顯著。

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化還原型特利加壓素氧化工藝

2.2.1 還原型特利加壓素氧化工藝響應(yīng)曲面因子的確定

根據(jù)因子篩選試驗(yàn)結(jié)果,采用響應(yīng)曲面設(shè)計(jì)試驗(yàn),根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選擇對(duì)還原型特利加壓素氧化工藝有顯著影響的三個(gè)因素：反應(yīng)時(shí)間(X1)、反應(yīng)pH(X3)、反應(yīng)溫度(X5),進(jìn)行三因子三水平的響應(yīng)曲面試驗(yàn)。本次研究以氧化率為響應(yīng)值,見表5。

表5 響應(yīng)曲面試驗(yàn)因子水平及編碼

2.2.2 還原型特利加壓素氧化工藝響應(yīng)曲面試驗(yàn)及方差分析

根據(jù)表5,設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度,進(jìn)行15 次試驗(yàn),試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過分析軟件進(jìn)行表6 響應(yīng)曲面回歸分析,得到如下多元二次響應(yīng)曲面回歸模型：

Y(%)=-2.101+0.00948X1+0.754X3+0.00969X5-0.0001 44X1X1-0.05065X3X3-0.000108X5X5-0.000142X1X3-0.0000 29X1X5-0.000450X3X5,模型方差分析見表7。

由表7 可以看出,一次項(xiàng),平方項(xiàng),X3,X3X3,X1,X1X1顯著；X5X5具有一定顯著性,其余項(xiàng)均不顯著,將雙因子交互作用刪除,優(yōu)化后的模型如下：

表7 回歸模型方差分析

Y(%)=-1.963+0.00769X1+0.7387X3+0.00544X5-0.000144X1X1-0.05065X3X3-0.000108X5X5,模型方差分析見表8。

表8 回歸模型方差分析

由表8 可以看出,X1,X1X1,X3,X3X3顯著；X5X5具有一定顯著性,各個(gè)因子對(duì)還原型特利加壓素氧化率影響顯著性順序依次為反應(yīng)pH＞反應(yīng)時(shí)間＞反應(yīng)溫度。氧化工藝回歸模型的一次項(xiàng)和平方項(xiàng)均顯著,說明各因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡單的一次線性關(guān)系；模型項(xiàng)顯著,說明該模型有效且具有可信性和準(zhǔn)確性；失擬項(xiàng)不顯著說明模型無失擬,試驗(yàn)誤差很小。

2.2.3 還原型特利加壓素氧化工藝響應(yīng)曲面分析

做出響應(yīng)曲面,分析反應(yīng)時(shí)間(X1)、反應(yīng)pH(X3)、反應(yīng)溫度(X5)對(duì)還原型特利加壓素氧化率的影響情況,結(jié)果見圖1。

由圖1 可以看出,隨著反應(yīng)時(shí)間的增加,還原型特利加壓素氧化率增加,當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到26.72min 時(shí),反應(yīng)基本達(dá)到平衡,繼續(xù)增加反應(yīng)時(shí)間,將會(huì)引起副反應(yīng)產(chǎn)生,降低氧化率。隨著反應(yīng)pH 的升高,還原型特利加壓素氧化率先升高后陡降,當(dāng)反應(yīng)pH 為7.29 時(shí),氧化率最高,這是因?yàn)榘腚装彼嵩趬A性溶液中易被氧化,但反應(yīng)pH 值過高時(shí),將會(huì)引起副反應(yīng),降低氧化率。隨著反應(yīng)溫度的升高,還原型特利加壓素氧化率先升高后降低,當(dāng)反應(yīng)溫度為25.25℃時(shí),氧化率最高,這是因?yàn)榉磻?yīng)溫度高,反應(yīng)物活性大,反應(yīng)速度加快,使得氧化率提高,但溫度過高時(shí),將會(huì)引起副反應(yīng),降低氧化率。

圖1 各因子影響還原型特利加壓素氧化率的響應(yīng)曲面

通過分析軟件進(jìn)行還原型特利加壓素氧化工藝參數(shù)優(yōu)化,最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)時(shí)間26.72min、反應(yīng)pH7.29、反應(yīng)溫度25.25℃,最高氧化率為90.14%。采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行三次驗(yàn)證試驗(yàn),得到的還原型特利加壓素氧化率分別為90.29%,90.07%,90.18%。

3 結(jié)論

本研究采用過氧化氫氧化還原型特利加壓素,先通過部分析因方法進(jìn)行因子篩選試驗(yàn),然后通過響應(yīng)曲面法的Box-Benhnken 模型對(duì)還原型特利加壓素的氧化工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立了二次多元回歸模型方程, 并對(duì)影響氧化率的各因子進(jìn)行分析探討。

試驗(yàn)結(jié)果表明,在五個(gè)主要因子中,樣品濃度(以還原型特利加壓素計(jì)算)、氧化劑與樣品摩爾比(以還原型特利加壓素計(jì)算)對(duì)還原型特利加壓素氧化率的影響不顯著。反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH、反應(yīng)溫度對(duì)還原型特利加壓素氧化率的影響顯著,其中各個(gè)因子對(duì)氧化率的影響顯著性順序依次為反應(yīng)pH(X3)＞反應(yīng)時(shí)間(X1)＞反應(yīng)溫度(X5)。優(yōu)化后的還原型特利加壓素氧化率的二次多元回歸模型方程如下：

Y(%)=-1.963+0.00769X1+0.7387X3+0.00544X5-0.000 144X1X1-0.05065X3X3-0.000108X5X5

本試驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)條件為：反應(yīng)時(shí)間26.72min、反應(yīng)pH7.29、反應(yīng)溫度25.25℃,在該條件下還原型特利加壓素的氧化率為90.14%。