肺磨玻璃結(jié)節(jié)患者血清炎癥因子及髓源性抑制細胞的表達水平及臨床意義*

郭婧瑤 駱瑩濱 吳建春 張博 李雁

肺結(jié)節(jié)是影像學直徑≤3 cm的局灶性、類圓形、密度增高的實性或亞實性肺部陰影，可為孤立性或多發(fā)性[1]。隨著人們對于健康的重視，以及常規(guī)體檢的普及，肺結(jié)節(jié)的診出率較前顯著提高。根據(jù)結(jié)節(jié)密度又分為實性和亞實性結(jié)節(jié)，磨玻璃結(jié)節(jié) （ground-glass nodule，GGN） 屬于亞實性肺結(jié)節(jié)，具有惡變風險。研究顯示約有75%持續(xù)存在的肺GGN最終會診斷為腺癌[2]。目前對于肺結(jié)節(jié)的研究集中在良惡性的診斷，主要以影像學結(jié)果為主，并參考腫瘤標志物等進行綜合評估。通常建議直徑＞1 cm的肺GGN采取有創(chuàng)性病理檢查或手術治療，直徑≤1 cm的肺GGN多以隨訪觀察為主。除去常規(guī)影像學檢查，以腫瘤標志物為主的臨床檢驗指標相對較為單一。研究顯示，肺GGN的主要原因與肺泡腔內(nèi)的滲出液、中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞浸潤有關[3]。上述細胞分泌的炎癥因子又可改變炎性微環(huán)境，促炎細胞因子表達增加會促進腫瘤的發(fā)展[4]。此外，MDSCs是一群處于不同分化階段的表型未成熟的髓樣細胞，涉及免疫調(diào)節(jié)的各個方面，包括慢性炎癥、感染、自身免疫性疾病，腫瘤等疾病[5]。前期研究也表明腫瘤患者外周血中的MDSCs水平與腫瘤負荷、分期以及多種惡性腫瘤的預后不良相關[6-7]。因此，本研究旨在探究直徑≤1 cm的肺GGN患者炎癥因子及MDSCs表達水平的臨床意義，以期為肺GGN患者的精準化管理和動態(tài)評估提供一定臨床依據(jù)，便于及時采取適當?shù)母深A措施。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

采用前瞻性研究方法納入2020年4月至2021年7月就診于上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院，肺GGN直徑≤1 cm的患者111例。納入標準：1）經(jīng)影像學明確診斷為肺GGN患者且首次確診時間≤3個月；2）肺GGN最大者直徑≤1 cm；3）年齡≥18歲；4）一般狀態(tài)良好，ECOG評分0～1分；5）入組前1個月內(nèi)未使用抗生素、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素類等藥物治療。排除標準：1）入組時診斷結(jié)節(jié)為惡性者；2）合并其他部位腫瘤或免疫系統(tǒng)疾?。?）隨訪期間進行藥物干預肺結(jié)節(jié)的患者。脫落（失訪）標準：1）隨訪期間無法通過電話及門診等隨訪方式聯(lián)系患者本人；2）入組后未按規(guī)定時間完成影像學檢查。本研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會批準（倫理批件號：2016SHL-KYYS-16），受試者均已簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 分組 參考肺結(jié)節(jié)診治中國專家共識根據(jù)肺結(jié)節(jié)直徑大小分為微小結(jié)節(jié)組（直徑＜5 mm）、小結(jié)節(jié)組（直徑為5～10 mm），其中微小結(jié)節(jié)組36例；小結(jié)節(jié)組75例。

1.2.2 臨床樣本采集及檢測方法 所有受試者在入組后采集靜脈血2 mL于促凝管中，經(jīng)本院檢驗科檢測炎癥因子（IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α）的表達。另采集靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，取血漿緩慢加入2 mL的淋巴細胞分離液（購自中國Yeasen公司），以300 g離心15 min后提取單個核細胞，加入2 μL FITC-CD33、PE-CD11b及PC5.5-HLA-DR流式抗體（購自美國Biolegend公司），避光染色30 min，經(jīng)PBS洗滌后用流式細胞儀檢測MDSCs百分比。采用FlowJo V10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 觀察指標 入組后檢測各組受試者炎癥因子（IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α）及MDSCs的表達水平，分析組間差異。然后每半年隨訪1次，根據(jù)影像學結(jié)果統(tǒng)計各組肺結(jié)節(jié)變化情況，分析肺結(jié)節(jié)變化的風險因素，對風險因素進行ROC曲線分析，測定截斷值，分析不同表達水平風險因素與疾病進展的相關性。本研究截止隨訪至2022年1月。研究終點（疾病進展）：1）經(jīng)胸部LDCT檢查發(fā)現(xiàn)肺GGN直徑增大≥2 mm；2）新出現(xiàn)的肺部結(jié)節(jié)[8]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料采用±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的資料采用中位數(shù)（M）和四分位數(shù)間距（interquartile range，IQR）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料的組間比較采用x2檢驗。采用Logistic二元回歸及ROC曲線進行單因素分析及臨床指標預測價值分析。繪制Kaplan-Meier生存曲線分析不同表達水平的風險因素對肺GGN進展的影響。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 微小結(jié)節(jié)組和小結(jié)節(jié)組比較

2.1.1 一般臨床資料比較 本次隨訪過程中微小結(jié)節(jié)組有3例患者和小結(jié)節(jié)組有5例患者因未能按時完成影像學檢查而失訪，根據(jù)納入和排除標準本研究最終納入111例患者，其中微小結(jié)節(jié)組36例，小結(jié)節(jié)組75例。兩組間性別、年齡、吸煙史、家族史、結(jié)節(jié)數(shù)量（分為孤立性和多發(fā)性結(jié)節(jié)）差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.1.2 炎癥因子及MDSCs表達水平比較 小結(jié)節(jié)組較微小結(jié)節(jié)組MDSCs比例升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.046），見圖1和表2。兩組間炎癥因子IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

圖1 流式細胞術檢測兩組間MDSCs百分比

表2 兩組間炎癥因子及MDSCs表達水平比較

2.1.3 肺GGN進展比較 兩組間患者疾病進展人數(shù)比較，結(jié)果顯示兩組間疾病進展率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 兩組間肺GGN變化率比較

2.2 肺GGN進展分析

2.2.1 肺GGN進展的單因素分析 經(jīng)單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)，肺GGN進展與結(jié)節(jié)數(shù)量、吸煙史、家族史、炎癥因子IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α表達無關，MDSCs比例是影響肺GGN進展的危險因素（P=0.046），見表4。

表4 肺GGN單因素分析

表4 肺GGN單因素分析 （續(xù)表4）

2.2.2 MDSCs比例與結(jié)局指標ROC曲線分析 經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，MDSCs比例對于肺GGN進展有一定預測價值。MDSCs的曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.781（95%CI：0.663～0.900，P=0.003）。統(tǒng)計分析得出MDSCs百分比最佳截斷值為4.57，見圖2。

圖2 MDSCs百分比與結(jié)局指標ROC曲線分析

2.2.3 不同MDSCs表達水平對肺GGN進展的影響分析 根據(jù)截斷值分為MDSCs高水平表達組（MDSCs≥4.57%）和低水平表達組（MDSCs＜4.57%）。生存分析結(jié)果顯示，MDSCs低水平表達組較高水平表達組的疾病穩(wěn)定期更長，差異具有統(tǒng)計學意義（P=0.001），見表5和圖3。

表5 不同MDSCs表達水平對肺GGN進展的影響分析

圖3 不同MDSCs水平患者疾病穩(wěn)定期的K-M曲線

3 討論

隨著高分辨率計算機斷層掃描和低劑量螺旋CT的廣泛應用，肺結(jié)節(jié)的檢出率較前顯著提高。國外的一項研究顯示，每年約有30%的胸部CT發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)[9]。影像學可通過影像學觀察結(jié)節(jié)的大小、形狀、邊界、密度、鈣化的存在、鈣化的模式、生長速度和葉的位置等綜合判斷結(jié)節(jié)的良惡性[10]。肺GGN持續(xù)超過3個月且直徑＞1 cm時，其惡性概率約為10%～50%[9]。通常管理直徑≤1 cm肺GGN患者建議定期復查胸CT。但是CT也存在一定的假陽性且不同研究的假陽性率差異很大，基線篩查的總體假陽性率為7.9%～49.3%。此外，過度的CT篩查和診斷也會造成醫(yī)療資源的浪費以及因不確定性增加患者的短期痛苦，增加患者抑郁情緒，甚或出現(xiàn)少見的因輻射誘發(fā)癌癥的情況[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)肺結(jié)節(jié)的發(fā)病與性別、年齡、職業(yè)暴露、吸煙、生活壓力以及慢性炎癥等有一定相關性[13-14]。本研究結(jié)果也顯示女性肺GGN患病率要明顯高于男性患者。Li等[15]通過薈萃分析53項臨床研究，納入8 793例肺GGN肺癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)其中女性比例、平均診斷年齡和不吸煙比例分別為0.62、56.97和 0.72，提示GGN肺癌患者的臨床特征可能脫離了高危因素。因此為了識別上述具有低風險因素的極早期 GGN肺癌患者，有必要重新考慮風險評估標準。

MDSCs存在于癌癥、慢性傳染病、創(chuàng)傷、敗血癥和許多其他病理狀況中具有免疫抑制活性并限制免疫反應的一類未成熟的髓系來源細胞。MDSCs主要由兩大群細胞組成，粒細胞或多形核（PMN-MDSCs）和單核細胞（M-MDSCs），前者在表型和形態(tài)上與中性粒細胞相似，后者在表型和形態(tài)上均與單核細胞相似[16]。在人類中，M-MDSCs表面分子標記物為CD11b+CD14+CD33+HLA-DRlow/neg，而G-MDSCs為CD11b+CD15+HLA-DRlowCD66b+[17]。MDSCs具有的免疫抑制功能可幫助腫瘤逃避免疫監(jiān)視，是促進腫瘤發(fā)展和進展的關鍵介質(zhì)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)同樣MDSCs在微小結(jié)節(jié)組和小結(jié)節(jié)組之間表達存在差異，小結(jié)節(jié)組MDSCs表達比例更高，同時與肺結(jié)節(jié)進展有相關性，說明隨結(jié)節(jié)增大患者更易出現(xiàn)免疫抑制情況，MDSCs是影響肺GGN進展的危險因素，或可為肺GGN進展預測提供一定參考依據(jù)。此外，MDSCs和炎癥因子之間也可互相影響。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6是MDSsC聚集和激活的關鍵調(diào)節(jié)因子，也是刺激腫瘤細胞增殖、存活、侵襲和轉(zhuǎn)移的一個因素[19]?？紤]肺結(jié)節(jié)的發(fā)生與慢性炎癥相關，炎性細胞及免疫細胞浸潤釋放炎癥因子將進一步影響GGN的發(fā)展?，F(xiàn)有的臨床研究也指出炎癥因子在區(qū)別結(jié)節(jié)良惡性方面有一定臨床意義[20-21]。因此，本研究還比較了微小結(jié)節(jié)與小結(jié)節(jié)患者之間的炎癥因子表達水平，但結(jié)果顯示無顯著性差異，說明直徑≤1 cm的肺GGN患者炎癥水平相當，對肺GGN進展無明顯影響。但因樣本量較少，所以可能存在假陰性的結(jié)果。

另外，本研究比較肺GGN大小與疾病進展的關系，發(fā)現(xiàn)微小結(jié)節(jié)和小結(jié)節(jié)在疾病進展率上無顯著性差異。這可能與直徑≤1 cm的肺結(jié)節(jié)惡性率較低且GGN多進展緩慢有關。通過進一步分析影響GGN進展的危險因素，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)大小、數(shù)量、吸煙史和家族史不是其獨立危險因素。相似的是同樣有研究表明肺癌概率不隨結(jié)節(jié)數(shù)顯著變化，基線結(jié)節(jié)計數(shù)無助于區(qū)分良性和惡性結(jié)節(jié)[12]。且因本研究中女性肺結(jié)節(jié)患者較多，有吸煙史人數(shù)較少，對于結(jié)果也會產(chǎn)生影響。

總體而言，本研究以直徑≤1 cm的肺GGN患者的血清炎癥指標和MDSCs表達水平為切入點，發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)大小與MDSCs的比例相關，同時MDSCs的表達水平與肺GGN進展也存在一定關聯(lián)。此發(fā)現(xiàn)豐富了肺GGN在免疫及炎癥指標方面的臨床研究，為肺GGN風險預測帶來積極的臨床意義。但是本研究也存在一定局限性，即所得結(jié)果提示MDSCs的臨床預測價值有限，還不足以建立準確的風險預測模型。同時因為樣本量較小，隨訪時間有限，對結(jié)果可能造成一定偏倚，因此后續(xù)還應擴大樣本量，以期為低風險GGN患者管理提供更多的臨床參考依據(jù)。