轉(zhuǎn) GhB301基因棉花抗枯萎病機(jī)理研究

朱金成，劉戈輝，張鵬飛，郭文婷，張 薇

(石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆石河子 832003)

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，中國是世界上最大的棉花生產(chǎn)和消費(fèi)國。棉花枯萎病是棉花的重要病害之一，由于常年連作，病害逐年加重，嚴(yán)重影響棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著棉花產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，培育抗枯萎病的棉花新品種是解決這個(gè)問題的最經(jīng)濟(jì)有效的方法。分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育棉花抗病品種提供了新的途徑[1]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)、行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子[2]。Guo等[3]從海島棉‘7124’克隆得到一個(gè)ERF類轉(zhuǎn)錄因子GbERF1-like，可以通過激活木質(zhì)素合成提高對黃萎病菌的抗性。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)在煙草中過表達(dá)GbERFb可以提高煙草對大麗輪枝菌的抵抗力。在擬南芥中，過量表達(dá)B3亞組的AtERF14能增強(qiáng)防衛(wèi)基因的表達(dá)，并能調(diào)控ERF1、ERF2等其他抗病相關(guān)ERF基因的表達(dá)。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)erf14突變體對枯萎病菌更加感病，且AtERF14的功能缺失不能被其他ERF互補(bǔ)；表明AtERF14在枯萎病抗性中表現(xiàn)出很重要的作用[5]。過量表達(dá)GbERF1可以提高棉花對大麗輪枝菌的抗性，而下調(diào)GbERF1基因則增加棉花對大麗輪枝菌的敏感性[6]。此外，ERF(亞)家族轉(zhuǎn)錄因子在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中也起到了重要作用。ERF(亞)家族轉(zhuǎn)錄因子的基因受多種信號分子的誘導(dǎo)而表達(dá)[7]。Guo等[8]研究發(fā)現(xiàn),棉花等多種高等植物受到黃萎病等真菌侵染時(shí)會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生許多小分子物質(zhì)，如乙烯和水楊酸等。Zhang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，小麥中的ERF(亞)家族轉(zhuǎn)錄因子TaERF3在對病原物白粉菌的抗性反應(yīng)途徑中發(fā)揮作用，從而激活植物對病原物的防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子作為植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物對病原菌脅迫響應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用。近年來，雖然人們已克隆了一些與抗枯萎病相關(guān)的ERFs家族基因，但仍有許多調(diào)控棉花抗枯萎病反應(yīng)的關(guān)鍵基因的功能尚不清楚。劉戈輝等[10]從高抗枯萎病的棉花品種中克隆了1個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子基因GhB301，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將其導(dǎo)入野生型棉花品種YZ-1并獲得純合株系，枯萎病抗性鑒定結(jié)果表明，過表達(dá)GhB301的轉(zhuǎn)基因棉花株系病情指數(shù)為 14.77%，顯著低于野生型對照(病情指數(shù)為 37.50%)，顯著提高棉花對枯萎病的抗性。本研究在此基礎(chǔ)上，通過分析GhB301基因?qū)γ藁共∠嚓P(guān)基因的表達(dá)及酶活性的影響，探討GhB301基因在棉花抗枯萎菌中的功能，為棉花抗枯萎病分子育種提供理論依據(jù)和基因資源。

1 材料與方法

1.1 棉花材料的種植

供試棉花材料為過表達(dá)GhB301轉(zhuǎn)基因棉花純合株系(OE)與野生型對照YZ-1(WT)，其中棉花轉(zhuǎn)基因純合株系在石河子大學(xué)綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)中獲得。將轉(zhuǎn)基因株系和野生型對照材料的種子分別用50～60 ℃的溫水浸泡30 min，放在發(fā)芽盒中于37 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng) 3 d。然后將發(fā)芽的種子清理好種植于營養(yǎng)缽中[V(花土)∶V(蛭石)=3∶1)]，放置于光照培養(yǎng)箱(光照16 h、25 ℃，黑暗8 h、23 ℃，濕度65%)中進(jìn)行培養(yǎng)，待棉苗第1片真葉完全展平時(shí)進(jìn)行接菌處理。

1.2 枯萎病菌的活化及接菌處理

供試菌株為枯萎病菌7號生理小種強(qiáng)致病菌株F430，由石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院棉花分子育種實(shí)驗(yàn)室提供?；罨筇羧尉溆诓槭弦后w培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min暗培養(yǎng)7～10 d，待菌液達(dá)到1×107個(gè)孢子/mL時(shí)對營養(yǎng)缽中棉苗進(jìn)行傷根處理，用注射器吸取10 mL菌液注射到傷口處，對照注射10 mL的去離子水。每次處理30株，重復(fù)3次，用于后續(xù)指標(biāo)測定。

1.3 抗病相關(guān)酶活性的測定

分別取轉(zhuǎn)基因棉花材料和野生型材料接菌后0、1、3、5、7 d的葉片，液氮速凍后，保存于-80 ℃冰箱。過氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性測定參考汪紅等[11]的方法，超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性測定參考Bailly等[12-13]的方法。

1.4 抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析

提取枯萎病菌處理后24 h的轉(zhuǎn)基因株系和對照系的根部RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進(jìn)行qRT-PCR檢測。內(nèi)參基因?yàn)镚hUBQ7，qRT-PCR反應(yīng)體系及程序設(shè)計(jì)參考TransStart Tip Green qPCR SuperMix說明書。共設(shè)置3個(gè)重復(fù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量[14]。用primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，引物由北京華大基因公司合成。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2010、SPSS 22軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花葉片防御酶活性分析

2.1.1 SOD活性變化 在接種棉花枯萎病菌后，無論是轉(zhuǎn)基因材料(OE)還是野生型材料(WT)中超氧化物歧化酶(SOD)活性都比相應(yīng)的接水對照(CK-OE、CK-WT)高，并且都隨著接菌時(shí)間的延長而出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，但其SOD活性大小與峰值出現(xiàn)時(shí)間不同(圖1)。其中轉(zhuǎn)基因材料的峰值出現(xiàn)較早，在接菌后的第3天，是同期轉(zhuǎn)基因接水的2.66倍，野生型材料峰值出現(xiàn)的較晚，在接菌后的第5天，是同期野生型接水的1.78倍。

2.1.2 POD活性變化 由圖2可知，兩個(gè)接水處理的棉花材料葉片中過氧化物酶(POD)活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且轉(zhuǎn)基因材料(OE)的POD活性均高于野生型材料(WT)，尤其是在第3天，是野生型接水對照(CK-WT)的2.20倍。在接菌處理后，轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，且轉(zhuǎn)基因材料的POD活性均高于相應(yīng)的野生型材料，轉(zhuǎn)基因材料在第3天達(dá)到峰值，而野生型材料在第5天才達(dá)到峰值；在接種后3 d時(shí)，轉(zhuǎn)基因接菌材料是轉(zhuǎn)基因接水材料的2.26倍，野生型接菌材料是野生型接水材料的1.56倍。

2.1.3 CAT活性變化 由圖3可以看出，在接菌處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因材料(OE)葉片CAT活性與野生型(WT)相比顯著增加；隨著接菌時(shí)間的延長，兩個(gè)棉花材料葉片CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，轉(zhuǎn)基因材料葉片峰值出現(xiàn)在接菌后的第3天，是同期轉(zhuǎn)基因接水對照(CK-OE)的2.57倍，野生型材料葉片CAT活性在第5天出現(xiàn)峰值，是同期野生型接水對照(CK-WT)的1.41倍。在接水處理的條件下，轉(zhuǎn)基因材料葉片的過氧化氫酶(CAT)活性與野生型材料無明顯差異；隨著處理時(shí)間的延長，野生型棉花葉片CAT活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，并且在第5天達(dá)到峰值，轉(zhuǎn)基因材料葉片中CAT活性變化不明顯。

表1 qRT-PCR所用引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

*和**分別表示同期接菌處理與接水對照間在0.05和 0.01水平存在顯著性差異；下同

圖2 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后POD活性變化Fig.2 Changes of peroxidase activity in transgenic and wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

2.1.4 PAL活性變化 如圖4所示，在接菌處理?xiàng)l件下，兩個(gè)材料PAL活性均出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，與POD、SOD活性不同的是，轉(zhuǎn)基因材料(OE)在第5天達(dá)到峰值，是同期轉(zhuǎn)基因接水材料(CK-OE)的3.04倍，但在野生型材料(WT)中PAL活性在第3天達(dá)到峰值，是同期野生型接水對照(CK-WT)的1.75倍。在接水處理?xiàng)l件下，兩個(gè)材料也都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但不明顯。

圖3 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后CAT活性變化Fig.3 Change of catalase activity in transgenicand wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

圖4 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后PAL活性變化Fig.4 Change of phenylalanine ammonia lyase activity in transgenic and wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

2.1.5 PPO活性變化 圖5顯示，在接種棉花枯萎病菌后，轉(zhuǎn)基因材料(OE)和野生型材料(WT)中多酚氧化酶(PPO)活性都比相應(yīng)的接水對照(CK-WT、CK-OE)顯著增加，并且都隨著接菌時(shí)間的延長而出現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，兩個(gè)材料的PPO活性峰值均出現(xiàn)在第3天，但其PPO活性大小不同。在第3天轉(zhuǎn)基因接菌材料是同期轉(zhuǎn)基因接水材料的2.98倍，野生型接菌材料是同期野生型接水材料的2.02倍。在接水處理的條件下，兩個(gè)材料的PPO活性變化也呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，峰值均出現(xiàn)在第5天，并且在第5天時(shí)轉(zhuǎn)基因接水材料的PPO活性顯著高于野生型接水材料，是野生型接水材料的 1.22倍。

圖5 轉(zhuǎn)基因材料與野生型材料接種枯萎病菌后PPO活性變化Fig.5 Change of polyphenol oxidase activity in transgenic and wild-type cotton plants after inoculation with Fusarium oxysporum

2.2 抗病相關(guān)基因的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步闡明GhB301在棉花枯萎病抗性中的功能，利用qRT-PCR方法測定轉(zhuǎn)基因棉花材料(OE)和野生型材料(WT)在接種枯萎病菌24 h后苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因、JA/ET路徑相關(guān)基因、SA路徑相關(guān)基因、PR基因等抗病相關(guān)基因的表達(dá)，如圖6所示。結(jié)果表明，與野生型材料相比，轉(zhuǎn)基因材料在枯萎病菌處理后除GhERF1、GhJAZ1、GhNPR1外，大多數(shù)基因均上調(diào)表達(dá)。

在苯丙烷代謝途徑中(圖6-A)，共檢測6個(gè)基因，其中GhPAL5、GhC4H1、GhC3H1、GhF5H2在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量均極顯著高于野生型材料，GhCCR1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量顯著高于野生型材料，GhHCT1在轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料中無明顯差異。

在JA/ET路徑中(圖6-B)，共檢測5個(gè)基因，其中乙烯合成的兩個(gè)關(guān)鍵基因GhAOS1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量極顯著高于野生型材料，GhAOC1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量顯著高于野生型材料；GhEIN2在轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料中無明顯差異，僅略高于野生型材料，而GhERF1和GhJAZ1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量均低于野生型材料，特別是GhJAZ1在轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達(dá)量顯著低于野生型材料。

在SA路徑中(圖6-C)，共檢測4個(gè)基因，其中GhICS1和GhEDS1在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量極顯著高于野生型材料，GhPAD4在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量顯著高于野生型材料，GhNPR1在轉(zhuǎn)基因材料和野生型材料中無明顯差異。

在PR基因中(圖6-D)，共檢測4個(gè)基因，其中只有GhPR4在轉(zhuǎn)基因材料中的相對表達(dá)量顯著高于野生型材料，另外3個(gè)基因在轉(zhuǎn)基因材料中僅略高于野生型材料。

綜上所述，在接種枯萎病菌24 h后，過表達(dá)GhB301棉花中與苯丙烷代謝途徑、JA/ET路徑、SA路徑、PR基因等多個(gè)抗病相關(guān)基因被激活，僅有個(gè)別基因的表達(dá)無明顯差異，由此推測過表達(dá)GhB301的轉(zhuǎn)基因棉花增強(qiáng)對枯萎病抗性的原因可能與抗病相關(guān)基因的激活有關(guān)。

A.苯丙烷代謝途徑相關(guān)基因相對表達(dá)量;B.JA/ET路徑相關(guān)基因相對表達(dá)量;C.SA路徑相關(guān)基因相對表達(dá)量;D.PR基因相對表達(dá)量

3 討 論

當(dāng)植株受到病原菌侵害時(shí)體內(nèi)會(huì)發(fā)生一系列的生理生化變化，包括組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變，以及相應(yīng)的物理化學(xué)的抗病反映[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)接種大麗輪枝菌后不同抗性棉花品種的PAL、POD、PPO、CAT等的酶活性隨著品種抗病性的增強(qiáng)而升高[17]。Gayoso等[18]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶有Ve基因的抗黃萎病番茄在受到黃萎病菌侵染后，PAL和POD的活性升高并且木質(zhì)素含量增加。SOD、GPX、CAT和APX可以清除細(xì)胞中的活性氧，以保護(hù)細(xì)胞免受過氧化傷害，并且轉(zhuǎn)基因植株的酶活性更高[19]。李娟[20]對轉(zhuǎn)基因抗病棉花品種與對照材料進(jìn)行接種枯萎病菌處理,發(fā)現(xiàn)其PAL、POD活性的變化趨勢基本一致，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，但轉(zhuǎn)基因抗病棉花的酶活性變化更快，峰值更高。本研究以過表達(dá)GhB301轉(zhuǎn)基因棉花純合株系和野生型對照為試驗(yàn)材料，接種棉花枯萎病菌后，發(fā)現(xiàn)棉花葉片SOD、CAT、PAL、PPO、POD活性逐漸增高，均呈先增加后降低的變化趨勢，轉(zhuǎn)基因棉花材料的SOD、CAT、POD、PAL、PPO活性均高于野生型材料，且SOD、POD、CAT活性峰值均早于野生型材料2 d左右，這與前人研究結(jié)果基本一致。

前人研究發(fā)現(xiàn)棉花代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量變化與植物抗病性相關(guān)。苯丙氨酸/酪氨酸代謝途徑是苯丙烷途徑的重要分支，通過此途徑可以合成木質(zhì)素[21]。植物木質(zhì)化程度越高，相應(yīng)的抗病性就越強(qiáng)[22]。木質(zhì)素合成相關(guān)基因可以通過正向調(diào)節(jié)木質(zhì)素合成和提高木質(zhì)素含量，來提高棉花對枯萎病的抗性[23]。JA/ET和SA現(xiàn)已被證明是植物與病原菌互作中重要的激素，植物受病原菌脅迫后能夠顯著改變這些激素的生物合成和下游信號相關(guān)基因的表達(dá)[24-25]。ERF1作為JA/ET響應(yīng)應(yīng)答調(diào)控因子起作用，超表達(dá)ERF1的擬南芥對枯萎病菌及其他一些腐生型真菌的抗性增強(qiáng)，ERF2也具有類似的功能[26]。研究發(fā)現(xiàn)GbERF1的表達(dá)受黃萎病的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過量表達(dá)GbERF1的轉(zhuǎn)基因擬南芥能增強(qiáng)多個(gè)病程相關(guān)蛋白基因的表達(dá)，與野生型擬南芥相比，對黃萎病的抗性也明顯提高[27]。李超[28]發(fā)現(xiàn)棉花和擬南芥通過增強(qiáng) JAZ1 來抑制茉莉酸通路激活赤霉素通路，從而降低棉花抗病性來調(diào)節(jié)植物正常的生長發(fā)育。本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測定接種枯萎病菌后轉(zhuǎn)基因棉花株系和野生型株系中抗病相關(guān)基因的表達(dá)，被檢測基因中大部分在轉(zhuǎn)基因株系中的相對表達(dá)量顯著高于野生型對照，推測接菌后有效提高苯丙烷代謝途徑、JA/ET途徑、SA途徑中相關(guān)基因和PR基因的表達(dá)，且JAZ1作為一個(gè)負(fù)調(diào)控因子表達(dá)量降低也得到驗(yàn)證。結(jié)合前期對轉(zhuǎn)基因棉花株系抗病性的鑒定，推測轉(zhuǎn)GhB301棉花株系對枯萎病抗性增強(qiáng)可能是由于GhB301基因的過表達(dá)引起棉花抗病相關(guān)基因表達(dá)量升高進(jìn)而增加了防御相關(guān)酶活性所致。