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    普通小麥4個主要矮稈基因的分子檢測

    2022-07-22 13:08:44牟麗明田秀苓董亞超何中虎
    西北農(nóng)業(yè)學(xué)報 2022年7期
    關(guān)鍵詞:矮稈冬麥區(qū)麥區(qū)

    牟麗明,田秀苓,劉 丹,董亞超,何中虎

    (1. 甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,甘肅定西 743000; 2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物科學(xué)研究所,北京 100081)

    株高是影響小麥生產(chǎn)潛力的重要農(nóng)藝性狀,適當(dāng)降低株高能夠增強小麥的抗倒伏能力,有助于提高收獲指數(shù),促進高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)[1]。20世紀60年代,矮稈基因Rht1和Rht2的應(yīng)用,促使了矮稈和半矮稈小麥品種的選育和推廣,極大地促進了全球小麥產(chǎn)量的增長[2-3]。

    小麥中正式命名的矮稈基因有25個,但應(yīng)用到育種中的卻很少,其中Rht1、Rht2、Rht8和Rht24應(yīng)用最為廣泛[4-9]。Rht1和Rht2屬于赤霉素遲鈍型基因,來自于Norin10,降低株高15%,增產(chǎn)24%左右[5]。Rht1和Rht2分布廣泛,世界上70%的育成品種中至少含有其中一個矮稈基因[10]。Rht8和Rht24都屬于赤霉素敏感基因,其中Rht8來自于日本品種Akakomugi,降低株高10%,對產(chǎn)量無不利影響[11-14];Rht24起源較早,在Norin10和Akakomugi中都能檢測到,降低株高6~8 cm,并且在世界小麥品種中分布廣泛,其中在國內(nèi)小麥品種(系)中分布頻率約為84%,國外小麥品種(系)中分布頻率約為67%[5]。

    分子標(biāo)記輔助選擇是一種有效的技術(shù)手段,利用分子標(biāo)記對小麥品種(系)進行分子檢測是開展分子育種工作的基礎(chǔ)。矮稈基因Rht1和Rht2已經(jīng)通過同源克隆的方法被克隆,Ellis等[15]開發(fā)具有互補性質(zhì)的STS標(biāo)記,但在實際應(yīng)用中因其特異性不足,并不能夠有效區(qū)分矮稈基因型和高稈基因型;隨著高通量KASP檢測平臺的建立,Rasheed等[16]根據(jù)Rht1和Rht2的基因序列開發(fā)KASP高通量功能標(biāo)記,能夠準(zhǔn)確、快速地檢測育種材料;隨后Tian等[5]也根據(jù)Rht1和Rht2的基因序列開發(fā)了檢測效果更好的CAPS功能標(biāo)記。矮稈基因Rht8近期已被克隆,最初SSR標(biāo)記Xgwm261常被用做檢測Rht8的有效分子標(biāo)記,但該標(biāo)記距離Rht8較遠且檢測出的變異類型較多[17-20];隨著對Rht8研究的深入,Gasperini等[12]開發(fā)與Rht8共分離的分子標(biāo)記DG273,擴增條帶391 bp代表矮稈類型, 421 bp代表高稈類型。Tian等[21]通過圖位克隆的方法克隆了矮稈基因Rht24并開發(fā)功能標(biāo)記,可利用該CAPS標(biāo)記TaCRY2對Rht24進行檢測。

    為更好的了解現(xiàn)有小麥品種和骨干親本中矮稈基因分布,本試驗利用目前發(fā)布的最有效的矮稈基因分子標(biāo)記對312份小麥材料進行檢測,為雜交組合的配制提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料與田間種植

    共檢測小麥品種(系)312份,包括40份北部冬麥區(qū)材料、229份黃淮麥區(qū)材料和43份國外材料,其中63份材料于2018-2019和2019-2020年度種植于北京,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所東圃場,2 m行長,2行區(qū),均勻撒播;將149份材料于2018-2019和2019-2020年度種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花所安陽試驗站,2 m行長,2行區(qū),均勻撒播(附表1)。所有材料均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

    1.2 DNA提取

    取苗期幼嫩的葉片0.2 g左右放入提前裝有鋼珠的2 mL離心管中,液氮迅速冷凍并用研磨儀(德國RETSCH MM400型)進行磨樣。采用CTAB法提取小麥基因組DNA[22],利用紫外分光光度計檢測DNA濃度并調(diào)整至50 ng/μL,轉(zhuǎn)移至96孔中保存待用。

    1.3 KASP檢測

    矮稈基因Rht1和Rht2采用Rasheed等開發(fā)的KASP標(biāo)記進行檢測(表1)。KASP標(biāo)記共3條引物A、B和C,其中C為共用引物,A帶Fam熒光基團,激發(fā)藍光,檢測野生型,B帶Hex熒光基團,激發(fā)紅光,檢測突變類型。KASP反應(yīng)體系為5 μL,主要包括DNA 1 μL(45 ℃烘干),2.5 μL Master Mix (LGC,北京),1.444 μL去離子水,0.056 μL混合引物(100 μmol/L的A、B、C工作原液按照A∶B∶C∶ddH2O = 12∶12∶ 30∶46的比例混合)。KASP反應(yīng)程序采用Touchdown程序,起始退火溫度設(shè)定為65 ℃,每個循環(huán)下降0.8 ℃。采用KASP熒光掃描儀(Pherastar,LGC)進行結(jié)果掃描,用Kluster caller軟件進行基因分型。

    1.4 PCR檢測

    利用各分子標(biāo)記對312份供試材料進行基因型檢測。矮稈基因Rht8采用共分離標(biāo)記DG273進行檢測,Rht24采用CAPS標(biāo)記TaCRY2進行檢測(表1)。PCR反應(yīng)體系為15 μL,包括1.5 μL模板DNA,7.5 μL 2×TaqPCR Mix(天維,北京),10 μmol/L上下游引物各1 μL,4 μL去離子水。PCR反應(yīng)在BioRad公司(http://www.bio-rad.com)MyCycler PCR儀上完成,其反應(yīng)程序為標(biāo)準(zhǔn)程序,DG273和TaCRY2的退火溫度分別為58 ℃和67 ℃。對TaCRY2標(biāo)記的PCR產(chǎn)物進行酶切,酶切體系為10 μL,包括5 μL PCR產(chǎn)物,1 μL 10×緩沖液,0.2 μL限制性內(nèi)切酶DpnⅡ(NEB,北京),3.8 μL去離子水,37 ℃孵育3 h。在20 g/L瓊脂糖凝膠電泳上進行電泳,200 V電泳45 min,在凝膠成像系統(tǒng)中波長為254 nm的紫外燈下觀察并拍照。

    1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

    在小麥成熟期,分別測量安陽試驗點149份材料和北京試驗點63份材料的株高,株高為莖基部到穗頂端的距離(芒除外)。采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。

    表1 檢測矮稈基因的分子標(biāo)記序列Table 1 Sequences of molecular markers for detection of dwarfing genes

    2 結(jié)果與分析

    2.1 4個主要矮稈基因檢測結(jié)果

    利用Rht1和Rht2位點的KASP標(biāo)記對供試材料進行檢測,若檢測結(jié)果是藍色(Fam)類型,則材料中含有高稈等位基因;若檢測結(jié)果是紅色(Hex)類型,則材料中含有矮稈等位基因;若檢測是粉色則代表無信號,針對粉色結(jié)果,進行二次檢測(圖1-A和1-B)。檢測結(jié)果顯示:在312份小麥品種(系)中,294份材料都至少含有一個“綠色革命”基因Rht1或Rht2,7份同時含有矮稈基因Rht1和Rht2,18份不含有這2個矮稈基因(表1)。

    圖A和B分別為 Rht1和 Rht2位點檢測結(jié)果;黑點代表對照水,紅點代表矮稈等位基因類型,藍點代表高稈等位基因類型,粉色代表無信號;圖C和D分別為 Rht8和 Rht24位點檢測結(jié)果;M代表DL 2 000,泳道1~10分別是‘良星66’‘北京0045’‘中麥415’‘中麥996’‘泛麥8號’‘濟麥20’‘泛育麥17’‘CA14043’‘農(nóng)大212’‘中麥895’

    利用與Rht8共分離標(biāo)記DG273對供試材料進行檢測,若擴增片段為421 bp,則表示該品種(系)含有Rht8矮稈等位基因;若擴增片段為391 bp,則表示該品種(系)含有Rht8高稈等位基因(圖1-C)。利用與Rht24緊密連鎖的CAPS標(biāo)記TaCRY2對供試品種(系)進行檢測,含有Rht24矮稈等位基因品種(系)的擴增條帶275 bp會被酶切成233 bp和42 bp兩個條帶;不含有矮稈基因Rht24的品種(系)的擴增條帶275 bp不會被酶切開(圖1-D)。

    2.2 4個矮稈基因及其組合分布頻率

    在供試的312份品種(系)中,Rht1、Rht2、Rht8和Rht24的分布頻率分別為18.9%、 77.6%、50.0%和91.3%。在國內(nèi)品種(系)中,Rht24的分布頻率(98.1%)最高,Rht2的分布頻率(83.6%)次之;在國外品種(系)中,Rht8的分布頻率(55.8%)高于Rht24(48.8%)、Rht1(39.5%)和Rht2(39.5%)。

    大多數(shù)品種(系)中至少含有2個或2個以上的矮稈基因。2個矮稈基因組合分析結(jié)果顯示:Rht2+Rht24的分布頻率(73.4%)最高,隨后依次是Rht8+Rht24(45.5%)、Rht2+Rht8(35.9%)、Rht1+Rht24(15.7%)、Rht1+Rht8(12.2%)和Rht1+Rht2(2.2%)。在3個矮稈基因的組合中,Rht2+Rht8+Rht24分布頻率最高(33.7%),然而,只有4份材料同時含有4個矮稈基因(表2)。

    表2 312份品種(系)中矮稈基因及其組合分布頻率Table 2 Distribution frequency of dwarfing genes and their combinations in 312 varieties

    2.3 不同麥區(qū)4個矮稈基因及其組合分布頻率

    在本研究選用的國內(nèi)276份冬小麥品種(系)中,北部冬麥區(qū)材料40份,黃淮麥區(qū)229份。Rht1在北部冬麥區(qū)的分布頻率(55.0%)高于黃淮麥區(qū)(8.7%),Rht2在黃淮麥區(qū)的分布頻率(91.7%)高于北部冬麥區(qū)(37.5%),Rht8在北部冬麥區(qū)的分布頻率(72.5%)高于黃淮麥區(qū) (45.0%),值得注意的是,Rht24在2個麥區(qū)的分布頻率都是最高的,其中40份北部冬麥區(qū)的品種(系)含有Rht24的品種(系)有39份;229份黃淮麥區(qū)品種(系)中,含有Rht24的品種(系)有225份。

    由于Rht1+Rht2同時存在的頻率很低,因此不再分析該組合類型。在含不同矮稈基因組合中,Rht2+Rht24在黃淮麥區(qū)的分布頻率最高,占90.8%,Rht8+Rht24在北部冬麥區(qū)的分布頻率最高,占70.0%。由于Rht1在北部冬麥區(qū)的分布頻率高,而Rht2在黃淮麥區(qū)的分布頻率高,因此在矮稈基因的組合分布頻率中表現(xiàn)為Rht1+Rht8、Rht1+Rht24和Rht1+Rht8+Rht24在北部冬麥區(qū)的分布頻率高于黃淮麥區(qū),而Rht2+Rht8、Rht2+Rht24和Rht2+Rht8+Rht24在黃淮麥區(qū)的分布頻率均高于北部冬麥區(qū)(圖2)。

    2.4 不同矮稈基因及其組合對株高的影響

    通過對供試材料4個主要矮稈基因(Rht1,Rht2,Rht8和Rht24)的檢測,結(jié)合兩年度其株高表型數(shù)據(jù),對不同基因及組合對株高的效應(yīng)進行了解析。不同矮稈基因和組合的株高在2個試驗點表現(xiàn)出類似的趨勢。在安陽試驗點149份材料中,Rht2的降稈效應(yīng)最強,平均株高84.5 cm,Rht1的平均株高為90.2 cm;在含有2個矮稈基因的材料中,Rht2+Rht24的材料株高最矮,平均株高84.5 cm,Rht1+Rht24的材料株高最高,平均株高91.8 cm;含有3個基因時,Rht2+Rht8+Rht24材料的平均株高矮于Rht1+Rht8+Rht24的材料,這也反映出Rht2的降稈效應(yīng)強于Rht1。在北京試驗點的63份材料中,在含有一個矮稈基因的材料中,Rht2的株高最低,為75.4 cm,Rht8的株高最高,為78.7 cm;在含有兩個矮稈基因的材料中,Rht2+Rht24組合類型株高最矮,為75.4 cm,Rht1+Rht8組合類型株高最高,為78.5 cm;在含有3個矮稈基因的材料中,Rht2+Rht8+Rht24組合類型的株高為 76.2 cm,低于Rht1+Rht8+Rht24組合類型,與安陽試驗點材料表現(xiàn)一致(表3)。

    NCPWWR=Northern China Plain Winter Wheat Region; YHRVFWWR=Yellow & Huaihe River Valley Facultative Winter Wheat Region

    表3 各基因型材料平均株高Table 3 Plant height under dwarf genes and their combinations cm

    3 討 論

    312份材料分子檢測結(jié)果分析表明,Rht24的分布頻率最高,廣泛存在于國內(nèi)外小麥品種中,其次分別為Rht2、Rht8和Rht1。前人研究對黃淮麥區(qū)129份小麥材料進行分子標(biāo)記檢測,發(fā)現(xiàn)含Rht8的材料最多(89份),含Rht2的材料73份,含Rht1的材料37份。這與本研究結(jié)果略有不同,可能與供試材料的遺傳背景及分布區(qū)域有關(guān)[23]。在中國,來自不同麥區(qū)的冬小麥品種(系)矮稈基因的分布頻率不同,主要體現(xiàn)在Rht1、Rht2和Rht8上,此外,Rht1在北部冬麥區(qū)的分布頻率高,而Rht2在黃淮麥區(qū)的分布頻率高,這種現(xiàn)象可能與不同麥區(qū)最初所用的矮源有關(guān)。

    在分析這4個矮稈基因的效應(yīng)時發(fā)現(xiàn),單獨含有某一矮稈基因的材料較少,很難對其進行單獨分析,各矮稈基因大多以組合的形式存在,這一方面是由于不同品種(系)所含矮稈基因類型和數(shù)目不同所造成的,另一方面可能與同一麥區(qū)矮稈背景相似有關(guān)[10]。同時,發(fā)現(xiàn)矮稈基因的降稈效應(yīng)存在疊加特性,育種利用時需注意選配矮稈基因組合。值得注意的是,本研究發(fā)現(xiàn)矮稈基因Rht2無論是單獨存在,還是與其他基因互作,其降稈效應(yīng)都稍強于其他幾個矮稈基因,這4個矮稈基因的降稈效應(yīng)由強到弱依次為Rht2>Rht24>Rht8>Rht1,在前人研究中,Rht1和Rht2的降稈效應(yīng)相差不大[24],這可能與供試材料的遺傳背景相關(guān),Rht8的降稈效應(yīng)與前人研究相似[25]。另外,含有矮稈基因越多的材料其株高不一定最矮,譬如Rht1+Rht8+Rht24基因型材料的平均株高為84.1 cm,均高于這3個基因單獨存在時的株高,一方面可能與材料有關(guān),另一方面可能由于矮稈基因間產(chǎn)生相互作用,導(dǎo)致株高發(fā)生變化。

    分子標(biāo)記開發(fā)是分子標(biāo)記輔助選擇育種的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。隨著標(biāo)記開發(fā)技術(shù)的不斷發(fā)展,標(biāo)記類型也不斷更新,由最初的STS和SSR標(biāo)記逐漸發(fā)展為通量高、價格低的KASP標(biāo)記。檢測Rht1和Rht2的標(biāo)記,有最初的STS基因特異標(biāo)記,也有后來開發(fā)的KASP和CAPS基因功能標(biāo)記。針對同一基因開發(fā)不同類型的多個標(biāo)記不僅為大家的檢測提供了多種選擇也可以使標(biāo)記間得到相互驗證。

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